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- 2026年01月31日
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CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ Cas）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来，能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中，进行有效的靶向编辑，具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。
CRISPR/Cas9系统中sgRNA（short guide RNA）识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂，通过细胞内的同源重组修复方式，将外源供体DNA定点导入至基因组的靶位点中，从而实现基因敲入。
将同时包含Cas9和gRNA序列的质粒载体与携带点突变的Donor载体（Oligo）共转入细胞核，Cas9和gRNA的复合物会引起靶位点DNA双链断裂，而后细胞以外源携带目标点突变的Donor作为模板进行同源重组修复，将目标点突变重组到基因组靶位点。Cas9和gRNA的质粒载体携带抗性基因，可进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出点突变纯合的阳性克隆。
二、服务流程：
细胞检测→载体构建→转染→药筛→单克隆挑选及培养→阳性鉴定→单克隆扩增和冻存。
三、技术应用： 1、细胞疾病模型造模：通过HDR，携带点突变序列的donor oligo (ssODN)替换WT对应的碱基。
2、细胞疾病模型修复：通过HDR，携带WT序列的donor oligo (ssODN)替换对应的突变碱基。
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文献和实验用蛋白或多肽标签融合于重组蛋白中，进而方便重组蛋白的纯化和检验。小分子标签通常免疫原性较低，且不影响目标蛋白功能而得以保留。但是大分子标签如 GST 因其对目标蛋白的结构和生物活性有所影响，通常需要去除。 今天我们就来聊一聊柱上酶切那点事儿~ 什么是柱上酶切 柱上酶切纯化路线是指在吸附了标签蛋白的层析柱上添加蛋白酶进行在位去除标签，具有更加灵活、高效、快速的特点。 相比于常规的洗脱后的酶切纯化路线，柱上酶切不仅可以简化酶切后的再次上样操作，同时可以尽量避免操作过程中目标
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