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1000
First-strand cDNA Synthesis Mix
-
2年
兰博利德
-20保存
100T
货号：F0202
储存条件：-20℃
产品组分 | 规格 |
All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix | 400ul |
dsDNase | 50ul×2 |
10×dsDNase Buffer | 200ul |
Nuclease-Free Water | 1ml×2 |
产品简介：
All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix是一款高效、便捷、减少污染的高质量一链cDNA合成试剂盒，包含M-MLV GIII Reverse Transcriptase及其反应Buffer、RNA酶抑制剂、dNTPs, Oligo(dT)20VN和随机引物等一链cDNA合成所需的所有组分，仅需加入RNA模板和水即可开始反应。使用该逆转录试剂盒获得的cDNA，下游可用于qPCR、普通PCR等实验。
本试剂盒采用dsDNase高效去除基因组DNA污染，区别于常规的DNase l, dsDNase 能够特异性的消化双链DNA (dsDNA以及DNA与RNA的杂合链)，并且具有热敏感性，可在高温条件下快速不可逆地失活。与传统使用DNase l去除基因组DNA污染的方法相比，dsDNase无需额外加入EDTA进行失活，不仅节省实验时间，而且降低了对逆转录反应的抑制。All-in-OneFirst-Strand Synthesis MasterMix (with dsDNase)作为升级后的一链cDNA合成试剂盒，15分钟内最长可获得12 kb cDNA。
可依据基因组污染严重程度选择采用去基因组DNA污染与反转录分开进行的操作方法，或者去基因组污染与反转录一步法进行的操作方法。
使用方法：
针对基因组含量低的RNA样品(推荐方案)
①于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
模板 RNAa | 50 ng~1ug |
All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix | 4ul |
dsDNase | 1ul |
Nuclease-Free Water | To 20ul |
a. 推荐采用试剂盒提取的 RNA 作为模板
② 轻柔吸打混匀，瞬离；
③ 37℃温育2min，以去除基因组DNA污染；
④ 55℃温育15 min;
⑤ 反应结束后，85℃温育5 min以终止反应;注：若RNA中基因组DNA污染严重，可适当延长37℃温育时间至5 min。
⑥ 迅速将获得的 cDNA置于冰上，用于后续实验;或立即保存于-20°C。
针对基因组含量高 RNA 样品
1. 基因组 DNA 污染去除
①于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
模板 RNAa | 50 ng~1ug |
10x DNase buffer | 1ul |
dsDNase | 1ul |
Nuclease-Free Water | To 10ul |
a. 推荐采用试剂盒提取的RNA作为模板。
② 轻柔吸打混匀，瞬离;
③ 37°℃温育2 min，以去除基因组DNA污染;
注:若RNA中基因组DNA污染严重，可适当延长37℃温育时间至5 min。
④ 65℃温育2 min，使dsDNase失活，冰上放置。
2. 第一链cDNA合成
① 于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量（实验组） |
“实验 1”反应产物 | 10 μl |
All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix | 4 μl |
Nuclease-Free Water | To 20 μl |
② 轻柔吸打混匀，瞬离；
③ 50℃温育15min；
注：若目标RNA不含Poly(A)结构，可预先25℃温育10min。
④ 反应结束后，85℃温育5min，以终止反应；
⑤ 将获得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后续实验。
注：cDNA溶液置于-20℃储存，建议不超过1周；置于-80℃可长期储存。
注意事项
预混液中已经包含Oligo(dT)20VN和随机引物，不仅适用于包含Poly(A)结构的真核生物mRNA，也适用于不含Poly(A)结构的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不适用于miRNA等小RNA模板。
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