单细胞基因表达 Flex 是 10x Genomics 于 2022 年 3 月推出的新产品（原 Fixed RNA），通过探针杂交的方式捕获靶基因，再进行细胞捕获建库测序的新技术。该技术可锁定 RNA 的瞬时表达状态，解决了单细胞样本储存运输、多样本批量处理以及混样测序的问题，让单细胞转录组的研究更加灵活。
针对 FFPE 切片，使用二甲苯脱蜡，使用胶原酶、胰蛋白酶等多种酶来消化组织，制备单细胞悬浮液，进而抽核得到细胞核样本；建库时采用靶向基因的探针对杂交目标 RNA 分子后连接的原理，进而完成文库构建的过程；该方法可以用来分析数千个至数万个细胞核的基因表达，能够对人或小鼠的 FFPE 样本进行单细胞转录组分析。
单细胞基因表达 Flex 是基于探针杂交原理，简单来说就是对已知序列设计探针，然后将成对的探针与 RNA 进行原位杂交，之后对探针进行扩增，然后用 Gel Beads 捕获探针进行建库测序。
▲上图 单细胞基因表达 Flex 的探针杂交原理
首先，将 FFPE 样本制备成细胞核悬液，然后加入探针进行探针的杂交。如果是多样本混样，则需要在杂交后对样本进行等细胞数量的混合。混合计数之后取一定数量的细胞悬液进行上机捕获，在 PCR 仪中进行探针的连接和延伸。随后进行文库的构建和测序到最后的数据分析。
▲上图 单细胞基因表达 Flex 工作流程
单细胞 RNA 测序研究的范围和规模正在不断扩大，研究人员的目标是根据患者队列或多个治疗条件或时间点来分析更多的样本。Chromium 单细胞基因表达 Flex 分析不仅能对新鲜样本开展单细胞基因表达分析，还能对 PFA 固定样本及 FFPE 细胞和组织进行分析。尤其是 Flex 技术实现了 FFPE 样本在单细胞水平的研究，可以解锁大量储存在医院以及生物样本库中的 FFPE 样本的宝贵信息。
（1）扩大了样本范围：能对 FFPE 细胞和组织，以及 PFA 固定样本进行单细胞测序分析，而不再受限于是否有新鲜组织可用，可以解锁大量储存在医院以及生物样本库中的 FFPE 样本的宝贵信息。
（2）简化了工作流程：FFPE 样本比较容易获取，易运输，并且样本收集相对经济成本低。使样本采集更加灵活，实验时间安排更加方便。
（3）提升了低表达基因检测灵敏度：根据 Flex 和单细胞 3RNA 的实测数据对比结果，在多种样本类型中，相同的测序数据量下，Flex 所得的测序数据饱和度更高，探针灵敏度更强，单个细胞内可以检测到的基因数更多。
（4）与 10X Visium FFPE 空间转录组更配：Flex 技术与 10x 推出的 FFPE 空间转录组技术完美结合，能够通过同一套探针对同一 FFPE 样本进行单细胞转录组与空间转录组研究，基因表达一致性更高，数据联合分析匹配性更好。
由于需要捕获探针捕获基因进行建库，因此需要有配套的探针的物种才可以开展实验。目前单细胞 Flex RNA 仅适用于人类和小鼠，并且只能进行基因表达应用（不能进行 ATAC-Seq 或 VDJ 测序）。对于 FFPE 样本，由于受蜡块年龄、组织类型、固定前组织质量、组织密度、组织面积以及其他因素的影响，致使相同面积和厚度的组织解离后获取的细胞数量也会存在较大差异。
1、FFPE 样本量要求
石蜡块： 蜡块被包埋组织体积需要 >0.5cm3
石蜡卷： 厚度 25μm 或 50μm 石蜡卷 3 卷以上，不可小于 25μm；被包埋组织横截面积需 >0.3 cm2 蜡卷完整不破碎，放入 1.5ml EP 管中，4 度避光保存和运输。石蜡卷如破碎较为严重，说明样本脆性较大，会影响样本质量。注：某些组织类型由于同等体积下细胞数量较少，可能需要提供更多蜡卷，例如穿刺样本、脂肪组织、肺癌、心肌等。
FFPE 保存年限：无明确年限要求，10x Genomics 已测试过长达 11 年的样本；已有文献表明相对于保存时间，固定时间对 RNA 质量影响更大（Trinks A，2024；Yunxia Guo，2023）。
2、FFPE 组织切片的细胞产量
在单个孔中可以检测多达 10,000 个细胞 / 核，即每个芯片最多可检测 80,000 个细胞。然而，装载的细胞或细胞核越多，可能出现的多胞率就越多。此外，更多的细胞意味着需要更高的测序数据量。一个常见的目标是每孔 8000 个细胞 / 核。10x 给出了一个样本准备推荐表，给出了样本类型，石蜡卷张数和横切面面积，以及相对应的细胞核得率。在这个表的基础上可以预估一下需要的蜡卷数量和厚度，最后两列细胞核的数量是 10x 用他们自己的方法做出来的细胞得率，伯豪生物用的是自己研发的方法抽核，细胞核得率和质量更有保证。
图 10X 给出的特定组织类型 / 切片的近似细胞产量
3、FFPE 组织核酸质量要求
核酸质检需要 DV200>30%（DV200 指长度大于 200nt 的 RNA 片段占总的 RNA 片段的比例）
4、FFPE 样本细胞核悬液的质控要求
因为要进行探针杂交，杂交结束要洗好几遍，中间会损失很多细胞核。所以单细胞核悬液中的细胞核总数量要大于 30 万个，而且核膜完整度 >80%，结团率 <10%。除此，还要求抽核后背景干净杂质少，杂质多的话会拉低中位基因数同时会有游离 RNA 的污染。
▲上图 解离后（左）和杂交后洗涤后的细胞计数（杂交后洗涤可减少碎片）
