HiFi II M-MLV (H-) Reverse Tra

HiFi II M-MLV(H-)是经过突变的M-MLV基因利用大肠杆菌工程菌进行重组与表达的 逆转录酶，该酶能够催化以RNA或DNA：RNA杂交链为模板的互补DNA聚合反应。经 过突变的HiFi II M-MLV(H-)逆转录酶RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降 解，更容易获得全长的cDNA。HiFi II M-MLV(H-)逆转录酶能在55℃合成第一条链 cDNA，提供更高的特异性，稳定性强，可以合成最大12 kb的cDNA，cDNA产量高。 适用于第一链cDNA的合成、RT-PCR、RT-qPCR以及全长cDNA文库的构建等。

活性定义：

以Poly（A）为模板，oligo（dT）为引物，在37℃条件下，10分钟内催化掺入1 nmol的dTTP所需酶量定义为一个活性单位(U)。 

质量控制：

200 U的本酶和1 µg的16 S，23 S rRNA在37℃下反应1小时，RNA的电泳谱带不 发生变化。  

注意事项：

1．在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门 的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经 常更换手套。 

2．实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙 酯）水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃 器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC 处理后进行高压灭菌。

3．本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心 后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。 

4．若起始RNA的量小于50 ng，建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供。

使用方法：

注意：10 ng-5 μg总RNA可建立20 μL反应体系，如果总RNA量大于5 μg，请按比例扩大反应体系。

i 逆转录操作步骤： 

1．将RNA模板、引物、dNTP Mix、SuperRT Buffer、HiFi II M-MLV(H-)和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。 

2．根据以下表格配制反应体系，总体积为20 μL。  

注意：若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶抑制剂（RNasin）。本试剂盒并未提供。

3．涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 

4．55℃孵育1-30分钟，85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 

5．逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。

ii 若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤： 

1．将RNA模板、引物、dNTP Mix、SuperRT Buffer、HiFi II M-MLV(H-)和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。

2．根据以下表格配制反应体系，总体积为15 μL 。  

3. 70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。 

4. 短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 

5. 向以上反应液中加入4 μL 5×SuperRT Buffer。

注意：若起始RNA的量小于50 ng，则建议加入RNA酶抑制剂(RNasin)。本试剂盒并未提供。 

6. 轻轻吹打混匀，若反转录引物为Oligo-dT Primer或Specific Primer时， 

7. 42℃孵育2 分 钟；若反转录引物为Random Primers，则25℃孵育10分钟。

8. 加入1 μL HiFi II M-MLV(H-) (200 U/μL)，轻轻吸打混匀。 55℃孵育50分钟。 85℃孵育5分钟。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。 

9. 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。