CX108 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(555红色荧光)
One-step TUNEL Cell Apoptosis Detection Kit (Red, Dye 555)
本产品需冰袋运输，-20°C避光保存，保质期12个月。
一步法TUNEL
货号规格一步法TUNEL

一步法TUNEL

产品简介一步法TUNEL
一步法TUNEL
dddd本产品采用TUNEL(TdT mediated dUTP Nick End Labeling)法，可高灵敏度且简单快速地检测 细胞凋亡，对于细胞样本(细胞涂片、细胞爬片、悬浮细胞)或组织样本(石蜡切片、冰冻切片)，只需经过 一步染色反应，洗涤后便可通过荧光显微镜或流式细胞仪检测被标记上红色荧光的凋亡细胞。一一步法TUNEL
步一步法TUNEL法一步法TU一步法TUNEL一步法TUNELNELTUNEL
dddd细胞凋亡时，细胞内的特异性核酸内切酶会被活化，并使染色质 DNA 在核小体间被特异性切割，DNA 降解成 180~200 bp 或其它整数倍片段。DNA 分子断裂产生的 3'-OH 末端可以在末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase，TdT) 的作用下结合 Dye555-dUTP，被标记的DNA 可以直接使用荧光显微镜观察或通过流式细胞仪进行定量分析，从而反映细胞凋亡的水平。一步法TUNEL
一步法TUNEL
dddd示意图如下：一步法TUNEL

一步法TUNEL

适用样本一步法TUNEL

ddod组织样本(石蜡切片、冰冻切片)及细胞样本(细胞爬片、细胞涂片、悬浮细胞)。一步法T一步法TUNELUNEL

一步法TUNEL

产品内容一步法TUNEL

一步法TUNEL

自备试剂一步法TUNEL

ddodDAPI、Triton X-100、1×PBS、4%多聚jia醛、无水乙醇。一步法TUNEL

一步法TUNEL

操作步骤一步法TUNEL

◆配置工作液一步法TUNEL
1×Proteinase K 工作液：(用于组织切片通透，细胞爬片/涂片无需使用)取1μL Proteinase K(2mg/mL)加入99μL 1×PBS中，混匀。现用现配。
1×DNase I 工作液：用去离子水按 1:10 的比例将 DNase I Buffer (10×) 稀释成 1×DNase I Buffer， 用 1×DNase I Buffer 按 1:100 的比例稀释 DNase I (30 U/μL)，使其终浓度为 0.3U/μL，现用现配。
注意：DNase I 会在剧烈混合下变性，建议不要涡旋 DNase I 溶液。一步

法TUEL

◆样本预处理一步法TUNEL
A. 贴壁细胞(细胞爬片/涂片)一步法TUNEL
1. 准备细胞爬片：在TC处理的细胞爬片上培养贴壁细胞。在对细胞进行凋亡诱导处理之后，吸弃爬片上的残留培养基，转步骤2；
1. 准备细胞涂片：以2×10⁶cells/mL的浓度将细胞重悬于1×PBS中。吸取50~100μL细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上，用一片干净的载玻片轻柔地涂开细胞悬液，转步骤2。一步法TUNEL
一步法TUNEL
2. 固定：将爬片/涂片浸入1×PBS配制的4%多聚jia醛溶液，常温进行细胞固定15min；一步法TUNEL
一步法TUNEL
3. 将爬片/涂片浸入1×PBS中漂洗2次；一步法TUNEL
一步法TUNEL
4. 轻柔地去掉多余液体，并用吸水纸吸干爬片/涂片上样本周围的液体；一步法TUNEL
一步法TUNEL
5. 通透：将爬片/涂片浸于1×PBS配制的0.2% Triton X-100溶液中，常温孵育10min；
一步法TUNEL
6. 用1×PBS滴加到样本上润洗样本2~3次。轻柔地去掉多余的液体，并用吸水纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。在实验过程中，切勿让样本干燥。处理好的样本需放入湿盒中保持湿润。
一步法TUNEL

B.悬浮细胞一步法TUNEL
1. 取3×10⁷~5×10⁷个细胞，加入三倍体积的 1×PBS，轻柔混匀，离心 5 min (300×g, 4℃)，弃上清；
一步法TUNEL
2. 固定：向细胞悬液中加入2mL 1×PBS配制的1%多聚jia醛溶液，4℃进行细胞固定20min；
一步法TUNEL
3. 离心5min(300×g,4℃)，弃上清，用1mL 1×PBS重悬细胞；
一一步法TUNEL步法TUNEL
4. 再次离心5min(300×g,4℃)，弃上清；
一步法TUNEL
5. 通透：加入 2mL 70% 乙醇 ( 冰上预冷 ) 缓慢吹打沉淀的细胞，冰上破膜 30 min；一步法TUNEL
5. 注意：①通透后的细胞折射率会下降，导致其边缘模糊不易观察，操作过程中应格外小心，避免丢失细胞；一步法TUNEL
5. 注意：②-20℃的条件下，细胞能在70%乙醇中保存一周。一步法TUNEL
一步法TUNEL
6. 将通透后的细胞离心5min(300×g,4℃)，弃上清，用2mL 1×PBS重悬细胞；
一步法TUNEL
7. 再次离心5min(300×g,4℃)，弃上清，用1mL 1×PBS重悬细胞；
一步法TUNEL
8. 转移2×10⁶个细胞至新的1.5mL离心管中，进行后续标记实验；若进行阳性对照制备，因为经DNase I处理后，细胞数量会减少一个数量级，所以需准备2×10⁷个细胞。一步法TUNEL
一步法TUNEL

C.石蜡切片一步法TUNEL
1. 脱蜡：将石蜡切片置于二甲苯中浸泡10min；换用新鲜二甲苯再浸泡10min；更换50%的二甲苯再浸泡5min；无水乙醇中浸泡5min；更换新的无水乙醇再浸泡5min；更换95%乙醇浸泡5min；更换85%乙醇浸泡5min；更换75%乙醇浸泡5min；更换50%乙醇浸泡5min；更换30%乙醇浸泡5min；更换1×PBS浸泡5min；一步法TUNEL
2. 通透：用吸水纸吸干载玻片上切片组织周围的多余液体，每个样本上滴加100μL 1×Proteinase K工作液，使溶液覆盖全部样本区域，37℃反应10min；一步法TUNEL
2. 注意：不同组织或物种的样本所需反应时长可能不同，Proteinase K通透时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险，时间过短则可能造成通透处理不充分，影响后续标记效率。建议进行预实验，确定最佳Proteinase K孵育时长。
3. 将通透后的样本用1×PBS润洗3次。轻柔地去掉多余液体，并用吸水纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。在实验过程中，切勿让样本干燥。处理好的样本需放入湿盒中保持湿润。     

2. 注意：若组织自发荧光较强，可在通透后向样本滴加荧光淬灭剂(50 mM 乙酸铵，1 mM 硫酸铜)，覆盖全部样本区域，处理10min，消除组织自发荧光干扰。再用1×PBS润洗5次，避免淬灭剂对TUNEL的影响。
一步法TUNEL
D.冰冻切片一步法TUNEL
1. 固定：将冰冻切片平衡至常温，浸入1×PBS配制的4%多聚jia醛溶液，常温固定15min；一步法TUNEL
2. 将固定后的冰冻切片用1×PBS润洗2次；一步法TUNEL一步法TUNEL
3. 通透：用吸水纸吸干载玻片上切片组织周围及背面的多余液体，每个样本上滴加100μL 1×Proteinase K工作液，使溶液覆盖全部样本区域，37℃反应10min；一步法TUNEL
3. 注意：不同组织或物种的样本所需反应时长可能不同，Proteinase K通透时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤中从载玻片上脱落的风险，时间过短则可能造成通透处理不充分，影响后续标记效率。建议进行预实验，确定最佳Proteinase K孵育时长。一步法TUNEL
4. 将通透后的样本浸入1×PBS漂洗3次，每次5min。轻柔地去掉多余液体，并用吸水纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。在实验过程中，切勿让样本干燥。处理好的样本需放入湿盒中保持湿润。

2. 注意：若组织自发荧光较强，可在通透后向样本滴加荧光淬灭剂(50 mM 乙酸铵，1 mM 硫酸铜)，覆盖全部样本区域，处理10min，消除组织自发荧光干扰。再用1×PBS润洗5次，避免淬灭剂对TUNEL的影响。
一步法TUNEL
◆标记及检测一步法TUNEL
1. 分组设置一步法TUNEL

一步法TUNEL
制备阳性对照一步法TUNEL
(1)向通透后的样本 ( 如果是悬浮细胞，需要离心去除上清 ) 加入 50 μL 1×DNase I 工作液 (0.3 U/μL)， 一定要覆盖住整个样本，常温孵育 10 min；
(2)将样本浸入1×PBS漂洗3次。
⑵注意：阳性对照必须使用单独的染色缸，否则其上残留的DNase I可能会使实验组出现假阳性信号。UNEL

2. 按照下表配制标记工作液(冰上操作，配制前请确保 Advanced 555 Labeling Mixture 已完全融化为液体)；一步法TUNEL

注意：以上为单个样本所需标记工作液的用量，50μL×样本/对照数量即为所需标记工作液的总体积。

一步法TUNEL

3. 标记与检测一步法TUNEL

A.对于细胞爬片/涂片、石蜡切片或冰冻切片一步一步法TUNEL法TUNEL
⑴用吸水纸吸去预处理后的样本上多余的液体，若样本为 9 mm 细胞爬片或相似面积的其它样本，在其上滴加 50 μL 上步配制的标记工作液即可完全覆盖样本，若样本面积较大，可按比例增加标记工作液用量，保证工作液完全覆盖样本即可；一步法TUNEL
⑴注意：①请严格避免孵育过程中发生干片；一步法TUNEL
⑴注意：②滴加标记工作液后，样本需要避光处理。一步法TUNEL
一步法TUNEL
⑵将样本置于湿盒内(湿盒的底部需加水保持湿润)，37℃避光孵育60min；一步法TUNEL
⑶轻柔地去掉样本上多余的液体，用1×PBS漂洗3次；    一步法TUNE
⑷用吸水纸轻柔地吸干样本周围多余的液体，并向样本区域滴加适量 1×PBS 配制的 20% 甘油 ( 例如 9 mm 细胞爬片需滴加 10 μL 20% 甘油 )，对样本进行封片，即可在荧光显微镜直接观察分析样本。若使用玻底培养皿进行观察，只需加入适量 1×PBS 保持样本湿润即可；
⑴注意：①无需使用抗荧光淬灭封片剂封片，只需保持样品表面湿润，4℃保存，荧光信号可保持一周；一步法TUNEL
⑴注意：②如需 DAPI 复染，可在甘油封片前加入用 1×PBS 配制的 2 μg/mL DAPI 溶液，常温避光孵育 5 min。用 1×PBS 漂洗 3 次后再进行甘油封片。一
⑸立即在荧光显微镜下观察分析样本。
一步法TUNEL
◇555 红色荧光染料的最大激发波长是 554 nm，最大发射波长是 567 nm；
一步法TUNEL
◇DAPI与双链DNA结合时最大激发波长是358nm，最大发射波长是461nm。

一步法TUNEL

B.对于悬浮细胞一步法TUNEL一步法TUNEL
一步法TUNEL
⑴对于2×10⁶个细胞的一个标准反应，所需标记工作液的用量是50μL。将预处理步骤准备好的2×10⁶个通透后的细胞离心5min(300×g,4℃)，弃上清，加入50μL标记工作液重悬细胞，37℃避光孵育60min，每隔15min轻弹管壁或用微量移液器轻轻重悬细胞；
一步法TUNEL
⑵将标记后的细胞离心5min(300×g,4℃)，弃上清，用 1×PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；
一步法TUNEL
⑶用 250~500 μL 1×PBS 重悬细胞；
一步法TUNEL
⑷流式细胞仪分析细胞或者涂片后在荧光显微镜下观察，参考前述激发 / 发射波长。一步法TUNEL

一步法TUNEL
结果验证

 

 

注意事项

1. 本说明书中推荐的实验条件是通用的，用户可根据不同的样本类型和预实验结果，对样本处理时间、试剂浓度等条件进行优化，以确定最适实验条件；
一步法TUNEL
2. 产品组分避免反复冻融；
一步法TUNEL
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
一步法TUNEL
4. 本产品仅限科研使用。一步法TUNEL

一步法TUNEL