一、实验目的
通过研究肿瘤细胞上清液诱导HMEC-1细胞形成管腔的能力,从而分析该细胞成瘤以及转移能力。
二、实验原理
肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程,一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤,一旦生长直径超过1-2 mm,都会有血管生成,这是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子,诱导血管生成。血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用,抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。
吉凯体外血管生成实验中,收集不同实验组别肿瘤细胞无血清上清液,刺激人脐静脉内皮细胞HMEC-1在Matrigel上形成管腔,通过CQ1仪器扫板分析比较各组别肿瘤细胞上清分泌物对血管生成的影响。
三、实验流程
四、实验材料
1. 主要试剂
胎牛血清、基础培养基、PBS、Matrigel、Calcein-AM、胰酶
2. 主要仪器
荧光显微镜、倒置显微镜、CO2培养箱、离心机、CQ1
五、实验步骤
(1) 细胞感染后,铺2×105个细胞于6孔板中,待贴壁后,PBS洗涤2遍[l1] ,换无血清培养基培养24 h,收集上清。
(2) 提前一天将Matrigel从-20℃中取出,4℃放置过夜融化,并将实验用孔板及*头-20℃预冷。[l2]
(3) 待Matrigel融化充分后,于预冷的96孔板中铺Matrigel,每孔70 μL,37℃凝固30 min,备用。
(4) 消化HMEC-1细胞,用无血清培养基洗细胞2-3次,尽量将血清去除干净[l3] ,用预先收集的目的细胞培养上清重悬为3×104细胞/100 μL[l4] [l5] ,每孔100μL加到(3)中备用的96孔板中。
(5) 37℃培养预设时间(2-4 h)[l6] 后,弃去旧液,每孔加入50 μL Calcein-AM[l7] 浓度为0.2μM的培养基37℃孵育5~10 min。
(6) 荧光显微镜下观察,发现细胞已被染色后,置于CQ1仪中扫板,获得图片及数据。
其目的是为了尽量除掉培养基中的血清,因为血清对HMEC-1细胞成管有很大影响。
[l2]Matrigel基质胶22-35℃温度环境下快速成胶,因此溶解时在4℃冰上过夜冻融(4度时会随着温度的上升部分成胶)。所有必须使用预冷的移液管、吸头及小管操作Matrigel。
[l3]其目的是尽量消除血清对实验结果的影响。
[l4]血管形成实验需要设置阳性对照(成管能力强):完全培养基(含血清)和阴性对照(成管能力弱或者不成管):基础培养基(不含血清)。
[l5]可以根据情况调整细胞密度,细胞密度在1.5×104~3×104/孔,有比较好的成管能力,如果太少成管不明显,太多细胞则会连成一片,观察不到管腔结构。
[l6]成管时间和细胞铺板密度有关(观察阳性对照组),所以铺的多成管需要的时间短,铺的少成管需要的时间多,因此什么时候染色扫板,根据自己观察的情况确定。
[l7]该试剂是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的的酯酶剪切形成Calcein,从而被滞留在细胞内,发出强绿色荧光