管形成实验

一、实验目的

    通过研究肿瘤细胞上清液诱导HMEC-1细胞形成管腔的能力，从而分析该细胞成瘤以及转移能力。

二、实验原理

肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤，一旦生长直径超过1-2 mm，都会有血管生成，这是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子，诱导血管生成。血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。

吉凯体外血管生成实验中，收集不同实验组别肿瘤细胞无血清上清液，刺激人脐静脉内皮细胞HMEC-1在Matrigel上形成管腔，通过CQ1仪器扫板分析比较各组别肿瘤细胞上清分泌物对血管生成的影响。

 

三、实验流程

 

 

四、实验材料

1.    主要试剂

胎牛血清、基础培养基、PBS、Matrigel、Calcein-AM、胰酶

2.    主要仪器

荧光显微镜、倒置显微镜、CO2培养箱、离心机、CQ1

五、实验步骤

（1）   细胞感染后，铺2×105个细胞于6孔板中，待贴壁后，PBS洗涤2遍[l1] ，换无血清培养基培养24 h，收集上清。

（2）   提前一天将Matrigel从-20℃中取出，4℃放置过夜融化，并将实验用孔板及*头-20℃预冷。[l2] 

（3）   待Matrigel融化充分后，于预冷的96孔板中铺Matrigel，每孔70 μL，37℃凝固30 min，备用。

（4）   消化HMEC-1细胞，用无血清培养基洗细胞2-3次，尽量将血清去除干净[l3] ，用预先收集的目的细胞培养上清重悬为3×104细胞/100 μL[l4] [l5] ，每孔100μL加到（3）中备用的96孔板中。

（5）   37℃培养预设时间（2-4 h）[l6] 后，弃去旧液，每孔加入50 μL Calcein-AM[l7] 浓度为0.2μM的培养基37℃孵育5~10 min。

（6）   荧光显微镜下观察，发现细胞已被染色后，置于CQ1仪中扫板，获得图片及数据。

其目的是为了尽量除掉培养基中的血清，因为血清对HMEC-1细胞成管有很大影响。

 

 [l2]Matrigel基质胶22-35℃温度环境下快速成胶，因此溶解时在4℃冰上过夜冻融（4度时会随着温度的上升部分成胶）。所有必须使用预冷的移液管、吸头及小管操作Matrigel。

 

 [l3]其目的是尽量消除血清对实验结果的影响。

 

 [l4]血管形成实验需要设置阳性对照（成管能力强）:完全培养基（含血清）和阴性对照（成管能力弱或者不成管）：基础培养基（不含血清）。

 

 [l5]可以根据情况调整细胞密度，细胞密度在1.5×104~3×104/孔，有比较好的成管能力，如果太少成管不明显，太多细胞则会连成一片，观察不到管腔结构。

 

 [l6]成管时间和细胞铺板密度有关（观察阳性对照组），所以铺的多成管需要的时间短，铺的少成管需要的时间多，因此什么时候染色扫板，根据自己观察的情况确定。

 

 [l7]该试剂是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的的酯酶剪切形成Calcein,从而被滞留在细胞内,发出强绿色荧光