ELISA检测

酶联免疫吸附试验 (以下简称ELISA) ：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
 

酶联免疫吸附测定法（ELISA）的基本原理涉及抗原或抗体与酶的结合及其随后的显色反应，具体如下：

• 将抗原或抗体结合到固相载体（如聚苯乙烯微孔板）表面，同时保持其免疫活性。

• 将抗原或抗体与酶通过某种方式（如共价键合）连接，形成酶标抗原或酶标抗体。这种连接不仅保留了抗原或抗体的免疫活性，也保留了酶的活性。

• 在测定过程中，将待检样本（可能含有特定抗原或抗体）与固相载体上的抗原或抗体进行反应。

• 通过洗涤步骤，去除未结合的样本和其他杂质，使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开。

• 加入酶标记的抗原或抗体，使其与固相载体上的抗原或抗体进一步反应并结合。¹²³

• 加入酶反应的底物，底物在酶的催化下发生显色反应，形成的有色产物的量与标本中受检物质的量直接相关。
• 根据颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的高效催化作用，这种方法具有较高的敏感度。

这种结合了抗原抗体特异性反应和酶高效催化反应的技术，可以用于检测样品中的特定抗原或抗体。

 

ELISA的检测方法

ELISA的检测方法有直接发、间接法、竞争法基双抗夹心法，其中直接法和竞争法应用较少，应有最多的是双抗夹心法，其在敏感性基因特异性上有明显的优势
 

直接法

将抗原固定于ELISA班上，然后用酶标抗体直检测抗原。

相较于其他类型的ELISA实验，直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，检测结果不容易出错，

但是由于直接ELISA的抗原不是特异性固定的，样本中的靶蛋白及其他杂质蛋白都会与ELISA版结合，实验背景会比较高，而且直接ELISA每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验不太灵活。另外由于没有使用二抗，信号没有被放大，降低了测定的灵敏度。

间接法

将抗原固定于ELISA班上，随后分两步进行检测：首先加入检测抗体于抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色。

于直接ELISA相比，间接ELISA用到酶标二抗，具有更高的灵敏度，也需要更少的标记抗体，更经济，间接ELISA还提供了更大的灵活性，

缺点：存在交叉反应的可能性（酶标二抗直接与抗原结合），可能会增加背景，同时与直接ELISA相比，间接ELISA实验多了二抗孵育的步骤，实验周期延长。
 

夹心法

被检测的抗原包被再两个抗体之间其中一个抗体将抗原固定于载体上，即捕捉抗体，另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量，或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量，这两种抗体必须小心选取，才可以避免交互反应货竞争相同额抗原结合部位。

竞争法

预先将抗原包被再固相载体上，并加入酶标记的特异性抗体，实验是，加入待检抗原（或抗体），如果待检物是抗原，则待检抗原于预先包被再固相载体上的抗原竞争结合酶标抗体，如果待检测物是抗体，则待检抗体就与系统中原有的酶标抗体竞争结合包被再固相载体上的抗原，通过洗涤洗掉被竞争结合的酶标抗体，最后加底物显色，需要注意的是显色结果与待检抗原（或抗体）的量成反比

竞争ELISA相对以上的三种方法更复杂一些，但以上三种ELISA类型都适用于竞争ELISA的形式，其主要有点在于可检测不纯的样品，且数据再现性高，但存在整体敏感性和专一性较差的问题。