人鼻腔上皮细胞

冻干粉：冻干菌粉、冻干管，一次性用完，不得留存
斜面：活化好的菌可直接使用，短期保藏，取用方便
菌液：直接在液体培养基中接种新鲜的培养物培养规定时间后形成的菌悬液，活菌、使用方便
平板：冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面
传代方法：
①准备上述平板2块；
②安瓿管表面消毒后在安全柜中打开，用酒精灯灼烧顶部，后迅速滴上无菌水使之破裂，随后用镊子将其敲碎；
③吸取0.5mL无菌水打入冻干管，充分溶解菌粉后，打入2块平板，200μL/个，涂布均匀；
④将平板置于上述培养条件下培养，菌种长出即可使用。
菌种鉴定：
（1）传统的生化方法对微生物进行正确的分类存在较大的困难。而随着分子生物学技术的发展，核酸序列分析已被广泛的应用于微生物鉴定中，通过基因序列分析，可以快速准确地对微生物的种属进行鉴定。目前、原核生物的种属鉴定主要采用16S rDNA测序技术，真核生物主要采用18S rDNA或ITS测序。
（2）16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基Rrna(16S rRNA)的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因组中。16S rDNA分子大小适中，突变率小，是细菌系 统分类学研究中最常用，最有用的“分子钟”。其序列包含9个可变区（variable region）和10个恒定区（constant region）。保守序列区域反映了生物物种 间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。16S rDNA的序列特征为不同分类级别的近缘种系统分类奠定了分子生物学基础。
（3）与细菌多样性分析类似，在真核微生物中也有三类核糖体RNA（rRNA），包括5.8S rRNA、18S rRNA和28S rRNA。18S rRNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列，其中既有保守区，也有可变区（V1-V9，没有V6区）。保守区域反映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则能体现物种间的差异，适用于作种级及以上的分类标准。其中，V4区是文献中常用的检测片段。
（4）ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS 2。 在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小（ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。
（5）使用PCR技术，对16S rDNA,18S rDNA或ITS序列进行扩增，然后PCR产物进行测序，即可获得相应的碱基序列。然后将序列在NCBI上进行Blast比对，即可获知与该序列同源性较高的已知序列，为确定菌种的分类学地位提供依据。
复苏步骤：
①冻存管从液氮或-80℃冰箱中取出放入PE手套中，迅速没入37℃水浴锅，摇晃冻存管加速溶解，以1min内全部溶解为宜；
②在超净台中将溶解好的细胞液加入到装有9mL完全培养基的离心管内，1000-1200rpm离心5min，弃去上清液，用1-2mL完全培养基重悬细胞。
③将细胞悬液加入到含有5-6mL完全培养基的T25瓶中，放入培养箱培养。
细胞传代：
①将旧培养液吸除，PBS清洗两遍后，加入1-2mL胰酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA）；
②镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时（可用吸管吸起些许胰酶轻轻吹打细胞层某处，肉眼可见细胞层脱落，即消化完成，否则继续消化），直接吸掉胰酶，加入5-6mL完全培养基，轻轻吹打细胞层，把细胞层吹落，吹散。
③将细胞悬液按1:2比例分到新的T25瓶中，添加适当的完全培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。；
④注意培养基pH值变化和细胞密度，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%-90%时，重复传代操作或者冻存。