RnaseOUT-RNase Inhibitor(80U/u

PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
RnaseOUT-RNase Inhibitor(80U/ul), 无甘油保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

描 述 ：

本酶为采用电子重构架技术重组表达的 RNase Inhibitor, 可高效的与 RNase A/B/C 形成 1：1 的复合物，从 而保护 RNA 免受降解。与野生型人源（human）、鼠源 (murine)、猪源(porcine) Inhibitor 比较来看，其在如下几方 面得到明显提升：（1）抗氧化/抗巯基类性能的提升，在 0-10mM DTT 浓度下，活性无明显差异，因此不仅适用于 PCR，也可适用于转录等高浓度 DTT 体系。（2）亲和力得 到明显提升，在特定条件下可以完全抑制 RNase，从而长效 保护体系中的 RNA 分子。（3）耐热性显著提高，在 55°C 条件下加热 10min 后，仍然保留 90%以上活性。 
单位定义：抑制 5 ng RNase A 的 50%活性所需的 RNaseInhibitor 量定义为一个活性单位。
热失活：65°C， 10min
应用：
cDNA 合成反应体外无细胞系统转录或翻译提高多聚核糖体的产量和活性
储存：-80°C 可保存 3 年，-20°C 可保存 2 年。
由于该制品不含甘油成分，反复冻融 10 次的情况下，活性损失<5%。如制品经常使用，融化后建议储存于 2-8°C（2个月），或分装后冻存。
使用方法
1. 按以下组分配制反应体系
Golden MLV Reverse Transcriptase 0.5-1 μl
10×RT Buffer 2 μl
dNTP Mixture (10 mM each) 1 μl
Total RNA or Poly(A) RNA 0.1-2 μg
20×Oligo dT(25)&Random Primer * 1 μl
RNase Inhibitor (80 U/μl) 0.25 μl
RNase Free H2O Up to 20 μl
*注：Oligo dT(15)使用浓度为 20~50μM, 如使用 Random9随机引物可使用 125μM，基因特异性引物可使用 5μM。
2．在 PCR 仪上按下列条件进行反转录反应
 30°C 15 min
 55°C 30~60 min
 85°C 10 min
 4°C
3. 反转录所得的 cDNA 可直接用于 PCR 反应或储存于-20°C。

货号	产品名称	规格
XG-P2997	RnaseOUT-RNase Inhibitor(80U/ul), 无甘油	40KU

 

 降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
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