HotStart RAPA3G DNA Polymerase

 

描 述 ：

末端转移酶（TdT）是一种不依赖于模板的 DNA 聚 合酶，催化脱氧核苷酸结合到 DNA 分子的 3’羟基端。带有 突出、凹陷或平滑末端的单双链 DNA 分子均可作为 TdT 的 底物，加尾长度可达 5~300nt。本酶经电子重构架技术筛选， 使其可以在 45°C 高温下反应，从而避免因 DNA 二级结构造 成的加尾效率下降。 该酶广泛用于 DNA 的 3’末端添加同聚物、利用修饰碱 基（如 ddNTP，DIGdUTP）标记 DNA 3’末端、TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记技术（细胞凋亡的原位检测）等试验。

活性定义：37 ℃ 60 分钟内，催化 1nmol dNTP 加入到多聚核苷酸 3’羟基末端中所需的酶量定义为 1 个活性单位
热失活：75°C 20min。
储存：-20℃ 可保存 3 年。
注意事项
1、适量 EDTA 可使 Terminal Transferase 的活性丧失。
2、金属离子螯合剂，较高浓度的铵根离子、氯离子、碘例子和磷酸根离子均对 Terminal Transferase 活性具有抑制作用。
3、DNA 末端 mol 数的计算，长度为 100bp 的 DNA：1pmol末端 DNA=0.33ng。

HotStart RAPA3G DNA Polymerase 为第三代 DNA 聚合酶，具有 5’-3’外切酶活性，不具有 3’-5’外切酶活性，其 具有最高的杂质耐受性（对乙醇、胍盐、肝素具有极高的耐 受性），因此对于纯度较差的 DNA 模板，该酶仍然可以获得 理想的实验结果。RAPA3G DNA 聚合酶为化学法修饰的 HotStart 版本，其在 50℃以下 100%无活性，只有 95℃条件 下加热 5min 后才能完全恢复酶的活力。因此该系统可以有 效抑制非特异性 PCR 扩增，极大的提高了 PCR 扩增特异性 和灵敏度。该酶配有独特的反应缓冲液，可在宽范围中得到 良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。

包装:

 

注意：
1. 5×HotStart RAPA3G Buffer 中未添加 Mg2+,配制反应时应加入适当浓度的 Mg2+,推荐反应终浓度为 2.5 mM。
2. HotStart RAPA3G DNA Polymerase (10U/μl)中不含甘油，可用于冻干 PCR。
储存：
请避光置于-80℃以下可保存 5 年，-20℃以下保存 2 年，经常使用请置于 4℃保存 2 个月。避免反复冻融。
使用说明：
1. 按照如下组分配制 50 μl PCR 反应体系：

注意：（1）在 50 μl 的 PCR 反应体系中 HotStart RAPA3GDNA Polymerase 的用量可在 0.1-0.5 μl 进行调整。（2）Mg2+的浓度通常在 2-4 mM 时可获得理想的扩增结果。
2. qPCR 扩增程序用两步法：
 Stage 1: 95℃ 5min
 Stage 2: 95℃ 10s
60℃ 30s 25-40 cycles
注意：由于该酶为化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶，必须于 95℃加热 5min 才能恢复酶的活性，该热启动步骤不能缩短时间。
3. 常规 PCR 三步法程序：
 Stage 1: 95℃ 5min
 Stage 2: 95℃ 10s
 50-60℃（退火） 20s
72℃ 4kb/min 25-40 cycles
Stage 3: 72℃ 5min
注意：由于该酶为化学修饰的热启动 RAPA3G DNA 聚合酶，必须于 95℃加热 5min 才能恢复酶的活性，该热启动步骤不能缩短时间。

 

货号	产品名称	规格
XG-P2987	HotStart RAPA3G DNA Polymerase(10U/ul,无甘油)	1000U

PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
HotStart RAPA3G DNA Polymerase(10U/ul,无甘油)保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
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