HotStart Bst 4.2 Red Bead(红黄变色

描述：该制品为全体系冻干微球制品，包含了 HotStartBst4.2 DNA/RNA 聚合酶、Helicaser、dNTP、Mg2+、反应缓冲盐、红黄指示剂，单球扩增体系为 25ul。

Bst4.2 具有以下性能：

（1）Bst 4.2 全系包含热启动Aptamer，该配体确保酶在<30℃时，酶活封闭效率>95%,在>60℃时 1min 内完全释放酶活。该特性利于室温建立反应体系，并大幅降低了低温条件下的非特异扩增；

（2）反应温度提升到 70℃，大幅降低引物 Dimer 的形成，提高扩增特异性，并使得粗样品核酸释放更加充分；

（3）全系包含 Helicaser，因此，允许在不使用 F3/B3 引物的情况下进行 LAMP 扩增（easy LAMP），并允许 FIP/BIP 的引物用量降低一倍。这将进一步降低非特异扩增，并使得扩增均一性大幅提升。LAMP 在反应时，会大量的消耗 dNTP，其副产物会导致指示染料由红色变为黄色，通过肉眼即可判读结果。
储存：-20℃干燥密封保存 24 个月；室温（25℃）密封保存 12 个月。避免受潮。
特殊说明：
（1） Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 在用于 LAMP 扩增时的推荐反应温度为 65-70℃，最佳反应温度为 70℃。因此其可完全替代  的Bst4.0 系列，用于标准 LAMP的扩增。
（2） 由于 Helicaser 的反应温度为 70℃，因此在进行eLAMP 扩增时，反应温度为 70℃。
（3）制品中包含高浓度的盐组分，使用时做好个人防护，防止制品与皮肤、眼、鼻、呼吸道等接触和吸入，一旦接触或吸入，请用大量的清水冲洗。
（4）防止气溶胶污染，尽可能进行分区操作。
1. 标准 LAMP 和 eLAMP 扩增的区别本试剂既可以用于标准 LAMP 扩增，也可以用于 eLAMP扩增。
1.1 10x 标准 LAMP Primer MixFIP/BIP=16 μM each; LF/LB=4 μM each; F3/B3=2 μM each
1.2 10xeLAMP Primer MixFIP/BIP=8uM each; LF/LB=4 uM each
注意：eLAMP（easy LAMP）为去除 F3/B3 引物的方法，为 Bst4.2 系列专用的使用策略，对于大多数引物组，在Helicaser 的加持下，扩增速度几乎不受影响。如引物扩效率低，可提高 FIP/BIP 浓度到 12~16 μM。
1.3 扩增温度不同标准 LAMP 扩增 eLAMP 扩增65-70°C 均可 70°C 反应
2. 配制 LAMP 反应体系HotStart Bst 4.2 Red Bead 1 个10x Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到总体积 25 μl反应体系配好后，置于 65-70°C 反应 20~30min，反应完毕后观察颜色，红色为阴性，黄色为阳性扩增。

货号	产品名称	规格
XG-P2965	HotStart Bst 4.2 Red Bead(红黄变色冻干球)	100Tx25μl

 

 PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
HotStart Bst 4.2 Red Bead(红黄变色冻干球)保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
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