HotStart Bst 4.2 L-HNB Bead(紫绿

公司产品仅供科研研究使用、不得用于临床诊断！

货号	产品名称	规格
XG-P2966	HotStart Bst 4.2 L-HNB Bead(紫绿变色冻干球)	100Tx25μl

描述：

该制品为全体系冻干微球制品，包含了 HotStartBst4.2 DNA/RNA 聚合酶、Helicaser、dNTP、Mg2+、反应缓冲、L-HNB 变色指示剂(Leuco-HNB, 隐色 HNB 染料)，其它稳定剂。

Bst4.2 具有以下性能：

（1）Bst 4.2 全系包含热启动
Aptamer，该配体确保酶在<30℃时，酶活封闭效率>95%,在>60℃时 1min 内完全释放酶活。该特性利于室温建立反应体系，并大幅降低了低温条件下的非特异扩增；

（2）反应温度提升到 70℃，大幅降低引物 Dimer 的形成，提高扩增特异性，并使得粗样品核酸释放更加充分；

（3）全系包含 Helicaser，因此，允许在不使用 F3/B3 引物的情况进行 LAMP 扩增（easy LAMP），并允许 FIP/BIP 的引物用量降低一倍。这将进一步降低非特异扩增，并使得扩增均一性大幅提升。制品中的 L-HNB 染料在反应起始前与 Mg2+结合产生深紫罗兰色，随着 LAMP 反应的进行，产生的 PPi（无机焦磷酸盐）结合体系中的 Mg2+，使得 L-HNB 显示出淡绿色。(L-HNB-Mg2+复合物) -> (PPi-Mg2+)+ (L-HNB)深紫罗兰色 淡绿色

储存：-20℃干燥密封保存 24 个月；室温（25℃）密封保存 12 个月。避免受潮。
特殊说明：
（1） Bst4.2 DNA/RNA Polymerase 在用于 LAMP 扩增时的推荐反应温度为 65-70℃，最佳反应温度为 70℃。因此其可完全替代  的 Bst4.0 系列，用于标准 LAMP的扩增。
（2） 由于 Helicaser 的反应温度为 70℃，因此在进行eLAMP 扩增时，反应温度为 70℃。
（3）制品中包含高浓度的盐组分，使用时做好个人防护，防止制品与皮肤、眼、鼻、呼吸道等接触和吸入，一旦接触或吸入，请用大量的清水洗。
（4）防止气溶胶污染，尽可能进行分区操作。
1. 标准 LAMP 和 eLAMP 扩增的区别本试剂既可以用于标准 LAMP 扩增，也可以用于 eLAMP扩增。
1.1 10x 标准 LAMP Primer MixFIP/BIP=16 μM each; LF/LB=4 μM each; F3/B3=2 μM each
1.2 10xeLAMP Primer MixFIP/BIP=8 μM each; LF/LB=4 μM each
注意：eLAMP（easy LAMP）为去除 F3/B3 引物的方法，为 Bst4.2 系列专用的使用策略，对于大多数引物组，在Helicaser 的加持下，扩增度几乎不受影响。如引物扩增效率低，可提高 FIP/BIP 浓度到 12~16 μM。
1.3 扩增温度不同标准 LAMP 扩增 eLAMP 扩增65-70°C 均可 70°C 反应
2. 配制 LAMP 反应体系HotStart Bst 4.2 L-HNB Bead 1 个
10x Primer Mix 2.5 μl
模板 DNA/RNA X μlddH2O 到总体积 25 μl反应体系配好后，置于 65-70°C 反应 20~30min，反应完毕后观察颜色，紫色为阴性，绿色为阳扩增。
注意事项：
（1）本制品在 1x 浓度情况下，对如下试剂的耐受度，Tris-HCl（pH8.0）≦10 mM; NaOH≦1 mM; Tween20%≦1%； EDTA(pH8.0) ≦20 μM； 肝素≦0.5 IU/ml。
（2）L-HNB 是还原状态下的染料，任何强氧化剂（H2O2）均会破坏 L-HNB 的结构，从而直接导致试剂变为深蓝绿色。

 PCR反应基本步骤：
一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：
变性(Denaturation)：
利用高温（93-98℃）使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前，通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。
退火或称接合,复性(Annealling)：
在DNA双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。
延伸(Extension)：
DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。
 

PCR 反应需要使用哪些试剂？
一、模板DNA：PCR反应需要模板DNA，如从细胞、组织、血液中提取DNA等；
二、引物：PCR反应的两个引物，分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域，引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物；
三、dNTPs：PCR反应中需要四种dNTPs，包括脱氧腺苷酸（dATP）、脱氧胸苷酸（dCTP）、脱氧鸟苷酸（dGTP）、脱氧胞嘧啶酸（dTTP），用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程，用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增；四、Taq DNA聚合酶：PCR反应需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等，用于扩增DNA链；
五、PCR buffer溶液：对PCR反应具有缓冲作用，调节反应pH，硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛，可增强PCR反应特异性，从而提高反应效率；
六、酶切体系：PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤，常常需要进行酶切操作。
七、MARK:一种分子量标准，用来判别DNA片段大小的工具。
八、DNA纯化试剂盒：用于纯化PCR反应产物；


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