8通道克隆菌落挑选仪

经验优化与高级技巧篇

短片段（5kb 以内）的序列克隆成功率。对于提高大片段克隆的成功率，可以从以下几方面考虑： ①选择合适的克隆载体，例如 pCC1-Brick 等适合装载大片段的载体； ②选择合适的克隆方法，通常无缝克隆技术如 Gibson 组装或者 Golden Gate 克隆对于大片段的组装效率更高； ③选择合适的纯化方式，纯化目的基因片段和线性化载体片段后再使用，并且注意两者的使用比例； ④选择合适的大肠杆菌感受态细胞，例如 stbl3，JM109 等； ⑤挑选单克隆菌落时需要注意，成功重组大片段的阳性单克隆菌落

结果分析篇

质粒浓度。   4. 提取质粒超螺旋比例太低 通常来说，超螺旋被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达量的质粒形态。如果提取质粒的超螺旋比例太低，可以从以下几个方面考虑优化： ①裂解缓冲液添加后，切勿裂解太长时间，不要超过 5 min； ②添加中和缓冲液后操作轻柔，切勿剧烈震荡，否则会导致超螺旋结构断裂为开环或线性形式； ③使用合适的菌株来扩增质粒，比如 endA–菌株； ④挑选多个单菌落进行小量质粒抽提检测，挑选超螺旋比例高的单菌落来扩繁摇菌抽提质粒; ⑤另外，超螺旋的比例还跟质粒

测序常见问题及其分析（图）

测序，便可解决。问题图3（测序引物有碱基缺失）图3测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'''端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。2、克隆测序时出现峰形重叠 原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染。 解决方法：重新挑单克隆的菌落