细胞周期流式分析

实验原理

1. P法是经典的周期检测方法，P是碘化丙庭(Propidium)，一种双链DNA的荧光染料，碘化丙和双链DNA结合后可产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比，细胞内的DNA被碘化丙呢染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可进行细胞周期和细胞凋亡分析。
2. 通常正常细胞的GO/G1 期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N)而S期的DNA 含量个于2N和4N之间。细胞用冰乙醇固定通透后，P可以与细胞的DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量,因此，可以通过流式细胞内DNA含量进行检测，将细胞周期区分为G1/G0 期，S 期和G2M 期,并可得出各个时期细胞百分数。

实验步骤

1. 胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入1ml 70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12小时以上。
2. PBS洗涤去乙醇，1000rpm, 5min，洗两遍。
3. 0.5mlPBS重悬细胞，加入PI和 RNaseA至终浓度50µg/ml，37℃ 温浴30 min。
4. 用流式细胞仪测定周期。

1. 培养细胞注意无菌环境.
2. 染液等物质有一定毒性，注意防护
3. 本实验上机检测所需收集细胞量较多，收集细胞时尽量多收集一些
4. 本实验对细胞离心，重悬次数较多，注意动作轻缓，避免过多地损伤细胞。
5. 固定时必须预冷PBS重悬打入无水乙醇中，二者顺序不可颠倒。
6. 培养细胞时，以对数期处理为宜，避免细胞量过少导致收集细胞量不足或者细跑量过多导致细胞开始大量死亡造成的实验误差6固定后细胞虽然可以保存较长时间后再上机检测，为避免不可控因素影响最好及早上机检测。