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- 详细信息
- 技术资料
- 库存:
大量
- 英文名:
ATP Content Kit
- CAS号:
WS5180W
- 保质期:
3个月
- 供应商:
上海瓦兰生物
- 保存条件:
4℃
- 规格:
48T/96T
| 规格: | 48T | 产品价格: | ¥690.0 |
|---|---|---|---|
| 规格: | 96T | 产品价格: | ¥940.0 |
本试剂盒仅供科研使用
ATP 含量(磷钼酸比色法)测定试剂盒说明书
(货号:WS5180W 微板法 96 样)
一、产品简介:
三磷酸腺苷(ATP)是生物体内能量转换最基本的载体,是生物体内最直接的能量来源,
测定 ATP 含量并且计算能荷,能够反映能量代谢状态。
肌酸激酶催化三磷酸腺苷(ATP)和肌酸生成磷酸肌酸,用磷钼酸比色法进行检测,
经波长扫描产物在 700nm 处有最大吸收峰,进而计算得到 ATP 的含量。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称
规格
保存要求
备注
提取液
提取液A 50mL×1瓶
提取液B 10mL×1瓶
4℃保存
试剂一
粉剂 mg×2 支
-20℃保存
用前甩几下或离心使粉体落入底部,每支再加入
1.1mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装
后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂二
液体 10mL×1 瓶
4℃保存
试剂三
粉剂μg×2 支
-20℃保存
用前甩几下或离心使粉体落入底部,每支再加入
0.55mL 蒸馏水溶解待用;用不完的试剂分装后
-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四
粉剂 mg×2 瓶
4℃保存
临用甩几下使粉剂落入底部,每瓶再依次加入
2.86mL 水混匀,最后加 1.14mL 浓硫酸(加浓
硫酸时务必小心,逐滴缓慢加入水中,注意防护)。
试剂五
液体 40mL×1 瓶
4℃保存
标准液
粉体 mg×1 支
-20℃保存
用前准确称取 2mg 粉体即 ATP 至一新 EP 管中,
再加 1.7mL
蒸馏水溶解即
2μ
mo
L/mL
,
再用水稀
释一倍成
1μ
moL/mL 标准品
,
待用
(-20
℃
保存,一
周内用完)。
【注】:全程操作需无磷环境;试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等,也可以用一次性塑料器皿,
避免磷污染。
三、所需的仪器和用品:
酶标仪、96 孔板、水浴锅、可调式移液枪、研钵和蒸馏水。
四、ATP 含量检测:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验
样本和试剂浪费!
1、样本制备:
① 组织样本:
称取约 0.1g 组织加入研钵中,加 0.5mL 提取液 A 进行匀浆,转至 EP 管中,于
12000rpm,室温离心 10min,取出 250μL 上清液至一新 EP 管中,再加入适量提取液 B
调 PH 至中性(用 PH 试纸测量,PH 在 6.5-8 之间均可)。再加蒸馏水定容至 0.5mL,
该液体待测备用。
【注】:也可以按照组织质量(
g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
② 细菌/真菌样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心弃上清;取500万细菌或细胞至研钵中,加0.5mL
提取液 A 进行匀浆,低温超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔本试剂盒仅供科研使用
2
10s,重复 30 次),于 12000rpm,室温离心 10min,取出 250μL 上清液至一新 EP 管中,
再加入适量提取液 B 调 PH 至中性(用 PH 试纸测量,PH 在 6.5-8 之间均可)。再加蒸
馏水定容至 0.5mL,该液体待测备用。
③ 液体样本:
澄清样本直接检测,若浑浊则 12000rpm,4℃离心 5min 后取上清液测定。
【注】:也可以按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例提取。
2、上机检测:
① 酶标仪预热 30 min 以上,调节波长到 700nm。
② 反应液配制:按照试剂四:试剂五=1:5 的比例混匀。用多少配多少的混合液。
③ 在 EP 管中依次加入:
试剂名称(μL) 测定管
对照管
标准管
(仅做一次)
空白管
(仅做一次)
样本
20
20
标准液
20
试剂一
20
20
试剂二
50
50
50
50
试剂三
10
10
蒸馏水
30
50
充分混匀,37℃准确水浴 30min
反应液
180
180
180
180
混匀,37℃水浴 20min,液体全部转移至 96 孔板中,在 700nm 下
读取各管吸光值 A(每个测定管需设一个对照管)。
【注】若 A 测定-A 对照的值小于 0.01,可增加取样质量 W(如增至 0.2g)或增加样本加
样量 V1(如由 20μL 增至 50μL,则试剂二相应减少);标准管仍为 20μL,其他试剂不变;
则改变后的 W 和 V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算:
1、按样本鲜重计算:
ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷(W×V1÷V)
=(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W
2、按细菌/细胞密度计算:
ATP 含量(nmol/104 cell)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷(500×V1÷V)×103
=2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)
3、液体中 ATP 含量计算:
ATP 含量(μmol/mL)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷V1
=(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)
C 标准---标准液浓度,1μmol/mL;
V---加入提取液体积,1mL;
V1---加入反应体系中样本体积,0.02mL;
V 标---标准品加样体积,0.02mL;
W---样本质量,g;
500---细胞或细菌总数,万。
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