DH5α-大肠杆菌感受态细胞

DH5α- 大肠杆菌感受态细胞
产品信息：
组成                      BC116-01                           BC116-02
DH5α- Competent cells                    10×100µl                            20×100µl
pUC19（0.1ng/µl）             5µl                                  5µl
储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。
产品介绍：
DH5α-菌株是实验室最常用的感受态细胞。缺失核酸内切酶 (endA1)，提高了质粒 DNA 的产量和质量；
重组酶缺陷型(recA1)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入 DNA 的稳定性；由于 lacZΔM15 的存在以及
lac lq 基因的缺失，故不需要加 IPTG，只需要添加 X-gal 就可进行基于α互补原理上的蓝白斑筛选实验。感受
态细胞经特殊工艺制作，pUC19 质粒检测转化效率大于 10 8 cfu/μg。
基因型：
F -φ80dlacZ ΔM15,Δ(lacZYA -argF )U169 deoR, recA1endA1hsdR17 (rK -, mK + ) phoAsupE44 λ -thi -1gyrA96 relA1
产品特点：
缺失核酸内切酶(endA1)，提高了质粒 DNA 的产量和质量；重组酶缺陷型(recA1)减少插入片段的同源重
组概率，保证了插入 DNA 的稳定性；由于 lacZΔM15 的存在以及 lac I q 基因的缺失，故不需要加 IPTG，只需
要添加 X-gal 就可进行基于α互补原理上的蓝白斑筛选实验。
操作步骤（以下操作均按无菌条件的标准进行）：
提示

感受态细胞应保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。

进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。

为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
1. 取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。
（一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用 DNA 体积
不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。）以下实验以 100μl 感受态细胞为例。
2. 向感受态细胞悬液中加入目的 DNA，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置 30 分钟。
3. 将离心管置于 42℃水浴中放置 60 秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 2 分钟，该过程不要摇
动离心管。（此步骤也可将离心管置于室温进行，时间不需十分准确，夏季或室温较高时，可放置 5-8
分钟左右；如果室温较低，可延长时间至 8-15 分钟左右。条件允许建议使用 42℃热激方法。）
4. 向每个离心管中加入 500μl 无菌的 SOC 或 LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于 37℃ 150rpm，摇床
振荡培养 60 分钟，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
5. 无菌条件下，取适量菌液加到含相应抗生素的 LB 固体培养基平板上，用无菌的细菌涂布器或玻璃珠将
细胞均匀涂开。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养 12-16 小时。（涂布用量可根据具
体实验来调整。转化质粒在 10ng 左右，90mm 平皿涂布 100µl，55mm 平皿涂布 50µl；连接产物的转
化菌液建议离心后倒掉大部分上清，余 200µl，取 100µl 用于涂布。）
6. 保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留。
（质粒快速转化步骤：将步骤 2 的时间缩短到 5 分钟，对于氨苄青霉素抗性的质粒，步骤 3 完成后，可
直接涂布或划线于含氨苄青霉素抗性的 LB 平板上。其它抗性的质粒仍需 60 分钟的复苏培养。）
相关试剂及培养基的制备方法：
1. LB 液体培养基：称取 10g Tryptone，5g Yeast Extract 和 10g NaCl 置于 1L 烧杯中。加入约 800ml 的去
离子水，完全溶解后用 2mol/L 的 NaOH 溶液调节 pH 值至 7.0。加去离子水定容至 1L。分装后，121℃
高压灭菌 20 分钟。
2. SOB 和 SOC 培养基：称取 20g Tryptone，5g Yeast Extract，0.5g NaCl 置于 1L 烧杯中加入约 800ml 的去
离子水，完全溶解后再补加 10ml 250mM KCl 溶液，滴加 5M NaOH（约 0.2ml）调 pH 至 7.0。加入去
离子水将培养基定容至 1L。121℃灭菌 20 分钟。使用时加入 5ml 灭菌的 2M MgCl2 溶液（此种培养基
称为 SOB）。再补加经 0.22µm 过滤除菌的 1M 葡萄糖溶液 2ml（此种培养基为 SOC）。
3. 转化复苏细菌用的液体 LB 培养基或 SOC 培养基：可以一次高压 50ml 液体培养基，无菌状态按 1ml
每管分装于高压灭菌的 1.5ml 离心管中，装于自封袋中，冻存于-20℃中，每次用一支。可以极大地避
免培养基污染和减少劳动量。
4. LB 固体选择培养基：100ml LB 液体培养基中加入 1.5g 琼脂粉，摇匀后，121℃高压灭菌 20 分钟。冷
却至 50℃左右时加入相应浓度的抗生素（如 AMP 浓度通常为 100µg/ml），混匀后倒在细菌用的无菌培
养皿中，等琼脂凝固后即可使用。
5. IPTG：称量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40 ml 灭菌水，浓度为 200mmol/L。用无菌 0.22μm
过滤膜过滤除菌。小份分装后，-20℃保存。
6. X-gal：用 DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20mg/ml，小份分装（1ml/份）后，-20℃避光保存。