GV3101 农杆菌电转感受态细胞；GV3101 电转感受态

GV3101 农杆菌电转感受态细胞

产品信息：
组成                                    BC308-01
GV3101 Electrocompetent cells                                      20×50μl
pCAMBIA2301 (10ng/μl)                                                 1 支
 
储存条件：-70℃保存，避免反复冻融。
基因型：C58 (rifR ) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) (StrR /GentR ), Nopaline type
产品介绍：
GV3101菌株为农杆菌C58型背景，核基因中含有利福平抗性基因Rif。此菌株还携带一种自身转运功能丧
失的质粒(disarmed Ti plasmid)。GV3101菌株含有pMP90 (pTiC58DT-DNA)，该质粒含有vir基因（vir基因是
TDNA 插入植物基因组所必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可
辅助植物双 元表达载体的T-DNA的转移）。pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒还含有Str和Gent抗性基因，赋予
GV3101菌株链 霉素和庆大霉素抗性。GV3101农杆菌适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操
作。GV3101 电转 感受态特别适用于大质粒的转化，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率大于10 5 cfu/μg DNA。
操作方法：
1. 电极间距为0.1cm的电转杯（Gene Pulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，压实冰
面，冰中静置5分钟，使电转杯充分降温。（电转杯重复使用方法：每次用完后，用大量的自来水冲洗
干净去掉菌液和DNA，用蒸馏水洗3遍，将其泡在75%乙醇中30分钟，取出杯子，沥干液体，放在超净
台中，使乙醇充分挥发，盖上盖子放干燥地方备用）
2. 取-70℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入10ng-1μg质粒DNA（洗脱或溶解质粒的
溶液中离子不能太高，可用双蒸水稀释：第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的最佳量），用手
拨打管底混匀，立即插入冰中，在超净台中用无菌吸头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上
杯盖，空管保留待用。
3. 启动电转仪，设置电击参数：C=25μF，PC=200ohm，V=2.4KV（此参数为BioRad公司推荐，依据不同
电转仪设置针对农杆菌合适的电击参数）。用纸巾擦掉电转杯外部的水分，将电转杯快速放入电转槽
中进行电击步骤。电击完成后，将电转杯快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB 并转移到原来保留
的感受态空管中，28℃，150-200rpm，振荡培养2-3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌，留取200μl左右上清轻轻吹打重悬菌块，取100μl的菌液涂布于含相应抗生素
的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天（当平板只含有50 μg/ml Kan 时，28℃培养48小时
即可；平板中同时加入50 μg/ml Kan，20μg/ml Rif时，需28℃培养60小时；如果使用的平板含有50 μg/ml
Rif则需要28℃培养72-90小时）。
注意事项：
1. 混入质粒时应轻柔操作，加入质粒的体积不应大于感受态体积的1/10，质粒不纯或超大质粒会导致转化
效率急剧下降。
2. 平板上菌落过多时，菌落很小。为了获得大的菌落，应减少质粒用量或减少涂布量，或将菌落转移到
新平板上生长。
3. 利福平使用的工作浓度浓度不应高于25 μg/ml，过高的利福平浓度会降低生长速度和转化效率。
4. 利福平具有防止杂菌生长筛选农杆菌的作用；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质
粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时可不考虑添加链霉素或庆大霉素，
Ti质粒丢失的概率极低（可忽略）。