RNA pull down

       RNA pull down是用于检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间互作的实验手段。RNA pull down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。也可以通过质谱检测实验进行未知的互作蛋白鉴定。

一、技术简介

   RNA pull down是用于检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间互作的实验手段。RNA pull down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过Western Blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。也可以通过质谱检测实验进行未知的互作蛋白鉴定。

 

二、技术原理

   首先标记RNA（如生物素探针标记 RNA），将其与细胞裂解液共同孵育，形成 RNA-蛋白质复合物，分离复合物得到蛋白质，通过蛋白免疫印迹（western blot）或质谱（massspectrometry）检测蛋白。

 

三、实验步骤

  1.生物素探针标记RNA的制备

  2.RNA抽提

  3.细胞裂解

  4.磁珠预处理

  5.RNA与磁珠结合

  6.RNA 与蛋白相互作用

  7.蛋白的检测
 

四、常见问题

1、RNA结合蛋白没有结合

    可能原因：（1）靶蛋白量不足；（2）缓冲体系不对；（3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低。

    解决方法：（1）增加上样蛋白量；（2）应用低盐体系；（3）加入交联试剂。

2、RNA 降解

    可能原因：无核酸酶的环境被破坏，比如RNA提取过程中的试剂及材料等；体外转录的RNA探针降解等。

     解决方法：清洗和使用新开的离心管和试剂等；RNA探针合成后，电泳检测其长度和浓度。

3、RNA结合蛋白的亲和力不够

    可能原因：结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探针用量不足等。

    解决方法：优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等。

4、结合的非特异性高

    可能原因：（1）缓冲环境没有优化；（2）缓冲环境严谨性低；（3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。

    解决方法：（1）优化孵育时间温度盐浓度等条件；（2）使用严谨性高的缓冲体系；（3）调低RNA探针和样品的比例；（4）提高裂解液的量。

5. WB信噪比高

    可能原因：（1）阳性信号率低；（2）一抗效率低；（3）蛋白没有充分溶解。

    解决方法：（1）增加二抗的量；（2）用敏感度的化学发光液；（3）用细胞裂解液预孵一抗；（4）增加样品的量；（5）确定有没有其他可能的结合情况；（6）增加裂解液用量。