JW102L PreScission 蛋白酶

PreScission 蛋白酶

PreScission Protease 

本产品需干冰运输；PreScission 蛋白酶 置于-80℃可保存 24 个月，-20℃可保存 6 个月，避免反复冻融； 10×PreScission 蛋白酶切缓冲液 置于-20℃即可保存 24 个月。
 

货号规格

goodJW102LS 1200 U 

goodJW102LS 1000 U
 

产品内容

注：① 一个 PreScission 蛋白酶单位(U)定义为在 4℃下，16h 内将 100µg GST 标签融合蛋白的90%完全切割所需的酶量；
注：② 本产品提供的 PreScission 蛋白酶缓冲液量如不足以用于实验，则需额外配制，10×PreScission 蛋白酶切缓冲液的组分为 500mM Tris-HCl，1.5M NaCl，10mM EDTA，10mM DTT，pH7.5。
 

产品简介

goodPreScission 蛋白酶是由人鼻病毒 3C 蛋白酶（Human Rhinovirus 3C Protease, HRV 3C）和谷胱甘肽巯 基转移酶（Glutathione S-Transferase, GST）融合形成的重组蛋白。PreScission 蛋白酶能特异识别 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro（LEVLFQ↓GP）短肽，并在谷氨酰胺（Gln, Q）和甘氨酸（Gly, G）之间发 生切割，常用于切除融合蛋白标签，如 pGEX-6P 系列载体自带该酶切位点，目标蛋白与该序列融合表 达，经 GST 标签纯化后，可用 PreScission 蛋白酶进行酶切去除 GST 标签。本产品也融合了 GST 标签， 可通过 GST 亲和层析柱去除。
 

使用说明

◆ 反应条件的优化

因为不同标签蛋白所具有的特性不同，需要对反应条件进行优化，具体操作如下：

1. 按下表依次加入相应样品和试剂，配制好酶切体系；

2. 混匀后，推荐 4℃反应 16 h 或过夜完成融合蛋白切割反应；
3. 取 20μL 酶切产物进行 SDS-PAGE 电泳分析，确定反应所需的合适酶量。在实际操作过程中， 如有必要，也可以在反应的不同时间点取少量酶切产物，后续通过电泳分析来确定zui 优的反应时长。
good注：对于绝大多数 GST 标签融合蛋白，按以下条件即可完成酶切：

gooddddd◆ 酶量：1:25~1:100（酶 U : 融合蛋白μg）

gooddddd◆ 反应温度：4℃

gooddddd◆ 反应时间：16 h 或过夜
 

◆ 柱上酶切 GST 标签融合蛋白（以 10 mg GST 标签融合蛋白/mL 凝胶为例）

1. 将  GST 标签融合蛋白结合于纯化柱并充分洗涤后，用 10 倍柱体积的 1×PreScission 蛋白酶切 缓冲液平衡纯化柱；
2. 每 100 μg GST 标签融合蛋白需使用约 2 U PreScission 蛋白酶（或按前述步骤优化后的条件）。 对于 10mg GST 标签融合蛋白，需使用 200U PreScission 蛋白酶，用 1×PreScission 蛋白酶 切缓冲液稀释至与凝胶柱相同的体积，即 1 mL； 
3. ►将稀释好的 1 mL PreScission 蛋白酶泵入纯化柱中，4℃酶切 4~8 h 或过夜。
3. ►如果蛋白结合是在离心管中进行的，可将稀释后的 PreScission 蛋白酶直接加入离心管中， 4℃在摇床上缓慢摇动 4~8 h 或过夜进行酶切；
4. ►用 1 倍柱体积的 1×PreScission 蛋白酶切缓冲液平衡纯化柱，重复三次，分别收集每次的洗脱液。
4. ►如果酶切反应是在离心管中进行的，先 1000×g 离心 2 min，收集上清，然后加入 1 mL 1× PreScission 蛋白酶切缓冲液重悬沉淀，1000×g 离心 2 min，收集上清，接着再加入 1 mL 1× PreScission 蛋白酶切缓冲液重悬沉淀，1000×g 离心 2 min，收集上清。
上述步骤收集的洗脱液或上清液中含有已切除 GST 标签的目的蛋白，而 GST 标签和带有 GST 标签的 PreScission 蛋白酶则仍然结合在凝胶上。

◆ 柱下酶切 GST、His 等标签融合蛋白（以 10 mg 标签融合蛋白/mL 凝胶为例）

1. 使用脱盐柱快速除去洗脱组分中的 GSH、咪唑等物质，或用 1×PreScission 蛋白酶切缓冲液 进行透析；
2. 按每 100μg 标签融合蛋白加入 2U PreScission 蛋白酶的比例加入蛋白酶（如果蛋白未定量，可 以按照每 1 mL 凝胶加入 200 U PreScission 蛋白酶），4℃酶切 4~8 h 或过夜；
3. 将酶切后的蛋白样品加入预先用 1×PreScission 蛋白酶切缓冲液平衡好的 GST 标签蛋白纯化 琼脂糖凝胶（货号：YJ105），室温结合 20~30 min；
4. 500×g 离心 5min，收集上清，其中含有已切除标签的目的蛋白，PreScission 蛋白酶则结合在 凝胶沉淀中。
4. 如果目的蛋白是 GST 标签融合蛋白，那么残留的未被酶切的 GST 标签融合蛋白、 PreScission 蛋白酶和酶切下来的 GST 标签都会结合在凝胶沉淀中，而已切除 GST 标签的目的 蛋白则在上清液中。

 

注意事项

1. 100 mM ZnCl₂、4 mM AEBSF 和 100 μM Chymostatin 会抑制 PreScission 蛋白酶活性 50%以上；
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
3. 本产品仅限科研使用。