LUMA整体甲基化检测

DNA甲基化是脊椎动物基因调控的重要表观遗传标记，异常甲基化通常与人类疾病如癌症有关。在哺乳动物中，甲基化主要发生在 CpG二核苷酸背景下的胞嘧啶碱基上。 CpG 岛是具有高 CpG 含量的基因组区域，并且通常位于基因启动子附近，在那里它们调节转录起始。

 

基因特异性和全基因组 DNA 甲基化可以用多种方法进行分析。LUMA是一种分析全基因组甲基化的快速有效的方法，已经在很多文献中详细描述。LUMA利用某些限制性内切酶的特殊性质，这些内切酶识别相同的靶序列，但是对甲基化敏感或不敏感。其中HpaII 和 MspI 通常用于 DNA 甲基化分析。这些酶识别 ccgg 序列，但只有 MspI 能够切断内部胞嘧啶C甲基化的基因序列。在 LUMA 的第一步，感兴趣的基因组在两个不同的反应中被消化，要么与 HpaII 和 EcoRI，要么与 MspI 和EcoRI。EcoRI作为一个内参酶，评估每个反应的裂解效率。在限制性消化后，使用焦磷酸测序通过单核苷酸延伸以定量方式填充所得的5’-cg ( HpaII 和 MspI)和5’-aatt (EcoRI)粘末端

LUMA优点是：无需亚硫酸盐修饰，无需引物，无需PCR过程，测序反应无需磁珠等试剂，十分钟左右即可完成测序反应，方便快捷。而且，该实验只需要200-500 ng的基因组DNA，并包含一个内控以消除起始DNA数量不同的问题。整个实验过程能够在6个小时内完成。

MspI 限制性内切酶可识别 C^CGG 位点，对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化不敏感。HpaII 限制性内切酶可识别 C^CGG 位点，对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化敏感。

材料与方法EcoRI 是一种DNA 的 G^AATTC限制性内切酶，对 dam 甲基化不敏感、对 dcm 甲基化不敏感、对 CpG 甲基化敏感。

应用全基因组 DNA/RNA mini 试剂盒提取待检测样本基因组 DNA。用Nanodrop 2000测定 DNA 浓度。如上所述(1)进行 Luma，但进行了小的修改。在37 °C 的热块中用PCR仪快速限制性消化20分钟。

对于每个 DNA 样品，设置两个不同的反应: 混合 A(HpaII 和 EcoRI)和混合 B (MspI 和EcoRI)。Pyromark q48 autoprep 的反应体积为6.5 μl，由0.25 μl EcoRI，0.25 μl hpaii 或 mspi，0.5 μl 反应缓冲液和5.5 μl dna/水组成。

焦磷酸测序时，将6.5 μl 的酶解产物转移到 Q48圆盘的每个孔中，并通过仪器自动添加6.5 μl 的Pyromark退火缓冲液。将核苷酸依次加入到加样仓中: 50μl dATP 和50μl 水至“ A”，50μl dTTP 和50μl 水至“ T”，50μl dCTP 和50μl dGTP 至“ C”，100μl 水至“ G”。 焦磷酸测序分配序列按照ACTCGA 核苷酸分配顺序进行。由此产生的热图包含前三个分配的三个主要峰。峰1和3(a 和 t)对应于由 EcoRI 产生的粘末端的填充，并且应该具有相似的高度，并且峰2(c + g)由 HpaII 和 MspI 粘末端的填充产生。运行后，高峰高度从Pyromark软件输出，并用以下公式计算甲基化水平:

% Methylation = 100 x [1 – (mix A peak 2 / mix A peak 1) / (mix B peak 2 / mix B peak 1)]

举例

甲基化率={1-[HpaII(C+G)/EcoRI(A)]/[MspI(C+G)/EcoR(A)]}×100, 上图中样本甲基化比率=57.12%

文献

1. Karimi, M., Johansson, S. and Ekstrom, T. J. (2006). Using LUMA: a Luminometric-based assay for global DNAmethylation.

Epigenetics : official journal of the DNA Methylation Society 1, 45–48.

2. Karimi, M., Johansson, S., Stach, D., Corcoran, M., Grander, D., Schalling, M., Bakalkin, G., Lyko, F., Larsson,

and Ekstrom, T. J. (2006). LUMA (LUminometric Methylation Assay) – a high throughput method to the analysis of genomic DNA methylation. Experimental cell research 312, 1989–1995