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Tunel凋亡实验
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上海威奥生物
Tunel原理:凋亡的一个特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或 DNA 被切割,出现单链或双链缺口,并产生与 DNA 断点数目相同的 3’-OH 末端,地高芯标记的 dUTP ( DIG-dUTP)标记至 3’-OH 末端,与生物标记的抗地高芯抗体( Anti-DIG-Biotin)反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶( SABC),然后加入显色底物 DAB 予以显示。
实验流程:
1.样品处理;
(1)细胞涂片和冰冻切片:
(2)组织:
2.灭活;
3.消化;
4. 标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 、TdT和、DIG-d-UTP ;
5.TBS 洗涤;
6.加封闭液 ;
7.加入生物素化抗地高芯抗体;
8. 加入 SABC;
9. DAB 显色;
10. 苏木素轻度复染、脱水、封片、显微镜观察。注意事项:
1、未打开的试剂盒贮存在-20℃(-15~25℃),一旦解冻, 以后就保存在4℃(2~8℃)下,避免反复冻融。
2、初次检测细胞凋亡,最好设置阳性和阴性对照片。
3、血细胞含量高的组织,尽可能延长过氧化氢的灭活时间。
4、使用新鲜的H2O2溶液,孵育后立即将标本放入PBS清洗 (H2O2可导致DNA损伤)
5、假阳性高是TUNEL检测的一个主要缺点。观察TUNEL阳性片是应对照HE切片。结合细胞HE染色来判断阳性的细胞 究竟是假阳性还是真正发生了凋
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