乙酰辅酶活性A检测试剂盒 | Acetyl-CoA含量测试盒

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于ATP合成。此外，乙酰辅酶A是合成脂肪酸，酮体，胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。

测定原理：
苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比，340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：
试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1支，-20℃保存。临用前加入250μL试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：液体10uL×1支，4℃保存。临用前加入250μL试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前加入22.5mL试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂五：液体30mL×1瓶，4℃保存。
工作液的配制：临用前请根据拟用工作液体积（样本数×0.23 m L），将试剂二、三和四按照1:1:90的比例混合，或者直接把试剂二和试剂三加入到试剂四中混匀（可以测定96样）；加样前置37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴锅中预热30 min；现配现用；

乙酰辅酶A的提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。



测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min，用蒸馏水于340nm处调零。
2、将工作液置37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴锅中预热10 min。
2、取25μL样本和230μL工作液至微量石英比色皿或者96孔板，混匀，立即记录340nm处20s的吸光值A1和80s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。