1000×拟南芥营养液(3种母液,除菌)
储存条件:短期常温储存,避免阳光直射;长期 2-8℃储存。
运输条件:常温运输
1000×拟南芥营养液(NS1060),也有实验室称为 PNS 营养液,分为 3 个组分,2-8℃可储存 1 年,分别称取 3 次即可快速配制 pH 值为 5.7 的营养液,无需调整 pH
使用方法:
1.根据用量,分别称取相同体积的三种储存液,依次加入 1000 倍体积的水中,混匀。
2.本品配制完成后 pH 值为 5.7,无需调整。如有特殊要求,可根据要求调整 pH 值。
3.施入配制好的营养液。
注意事项:
1.大量元素低温储存可能会有析出情况,恢复常温完全溶解即可使用。
2.三种母液不要同时加入,避免产生沉淀。
拟南芥培养方法:
拟南芥生长的适宜温度白天为 22℃-24℃,夜温 20-22℃,适宜的湿度为 60-70%,生长期适宜的光强为150μmol• S-1• M
-2(6 支 36W 日光灯下 35cm 处测得)。幼苗期不耐高光强,可适当遮荫。光质也较重要,应选用植物生长专用的日光灯。拟南芥属于长日照植物,在日照长于 12 小时下才会开花,一般拟南芥生长室的日照长度定于 14-16h 为佳。
1.准备育苗培养基:2.29 g/L 1/2 MS(PM1061),Sucrose(CS10581):10 g/L,pH5.7,Agar(CA1331):0.7-0.8 %.121℃灭菌 15 分钟,60℃左右在超净台内分装入直径 100mm 培养皿(25 mL)。
2.种子消毒:种子放在 1.5mL 离心管中,加入 1 mL 的种子消毒液(2% NaClO(市售 10%溶液)和 0.1%Triton-X100),消毒 10 min(移液器反复吸吹),用无菌水洗 5 次以上(移液器反复吸吹)。
3.点种:种子里可多加些水,用移液器吸取种子,均匀铺到培养皿上,可根据需要选择种植的密度(一般不超过 30 株,不要太密,否则根缠在一起不好移苗),用移液器吸除培养基表面上的水,并置于超净台内吹干培养皿表面上的水,密封盖子,4℃暗处理两天后(春化),移到光照培养箱(22 ℃,光周期 12 h),两周后再移苗。若种子较密,光照培养箱中生长 1 周则要移苗,且需适当遮荫。
4.移苗:将蛭石与珍珠岩按 3:1 的比例混好作为基质,装入营养钵,将营养钵放入不透水的平底塑料育苗盘,在育苗盘中加水至 3 cm 高,水就会通过营养钵的底孔渗入,待基质湿透即可移苗。用镊子轻轻从培养皿中连根拉出小苗,把根平放在蛭石表面,用镊子把根轻轻压入基质内,移苗后用保鲜膜覆盖营养钵3-4 天。从苗期直至开花,每隔 2-3 天浇一次水,始终保持育苗盘内有 1-3 cm 的水层,整个生长期浇 3-4次拟南芥营养液(NSP1060)。在收种期,不要浇水,保持育苗盘干燥。
5.收种:在种荚变黄,变干时收种。将种子抖落容器内,收集后用筛网除去杂质,将种子装入小纸袋中,标记好,置于干燥的环境中待种子进一步干燥后,封存于 1.5mL 离心管。
拟南芥的转化方法:
渗透培养基配制:2.29g/L 1/2MS(大量元素减半);5% 蔗糖;0.5% MES;用 KOH 调至 pH5.7;再加:10 μl/L 的 6-BA 母液(1 mg/mL,乙醇溶解);200 μl/L Silwet L-77(在蔗糖溶解后加入,否则蔗糖很难溶解)。经转化的拟南芥,种子收获后需在相应的抗性平板上筛选转化子。
1. 制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10 mL,转入200 mL大瓶过夜培养,农杆菌液OD600在1.2-1.6即可。
2.室温 5000 rpm 离心 15 分钟。
3.弃上清,将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里,OD600 在 0.8 左右为宜。
4.直接将拟南芥的花浸入农杆菌悬浮液,持续几秒钟,取出再浸入,反复 3-5 次。浸染后的植株平放在带有盖子的育苗盘中,或者用保鲜膜盖好,以保持湿度。移入恒温室避光培养 24 小时,第二天揭膜,正常光照培养。
转化子的筛选:
1.种子消毒:用种子消毒液(2% NaClO 和 0.1% Triton-X100)处理 10 分钟(移液器反复吸吹);然后用无菌水洗 5 次(移液器反复吸吹)。
注意:消毒时间不宜过长,否则影响种子发芽。
2.处理后的种子用移液器均匀涂布在固体筛选培养基表面。不宜过密,切忌将种子堆叠在一起。如种子特别容易污染,可在固体筛选培养基中加入工作浓度为 250 μg/mL 的头孢霉素(SL4090)抑制农杆菌的生长。
3.4℃避光春化 2 到 3 天,移入 22℃恒温箱培养。
4.观察种子在固体筛选培养基上生长情况, 相比于其他萌发的幼苗,具有长根的幼苗可确定为转化子时,将转化子移栽至浇透拟南芥营养液(NSP1060)的人工基质上培养。
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