HEK293 Host Cell DNA Residue D

产品信息

产品描述

 

HEK293细胞残留DNA检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的HEK293宿主细胞DNA残留片段含量的试剂盒。

本试剂盒采用qPCR荧光探针原理，专一快速的检测HEK293细胞的残留DNA，其最低检测限可以达到fg水平；UDG酶和dUTP的配合使用可以消除扩增产物带来的污染。试剂盒配套有HEK293 DNA Control（DNA定量参考品）。本试剂盒需要与宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒（Cat#18461/18462）配套使用。

 

产品组分

【注】：本试剂盒不含ROX参比染料，若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料，推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye（Cat#10200ES）。

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃储存，有效期1年。收到货后，建议将D组分HEK293 DNA Control储存于-80℃，其它组分储存于-20℃。

 

注意事项

 

1）加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

2）每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4）本产品仅作科研用途。

 

使用方法

 

一、HEK293 DNA Control的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer将HEK293 DNA Control进行梯度稀释，稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下：

1. 将试剂盒中的DNA Control和 DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 s。

2. 取6支干净的1.5 mL离心管，分别标记为 3 ng/μL，①，②，③，④，⑤。

3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL DNA Control，即稀释为3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心10 s，该浓度可分装置于－80℃短期保存（不超过3个月），使用时避免反复冻融。

4. 在 ①，②，③，④，⑤ 管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer，再进行梯度稀释，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
①	10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
②	10 μL ①+90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
③	10 μL ②+90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
④	10 μL ③+90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
⑤	10 μL ④+90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】1）每个浓度做3个复孔。该试剂可测试30 fg/μL-3 ng/μL线性范围，如需要，可扩大线性范围。

2）为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA Control分装储存于-80℃。

3）已融化未使用的 DNA Dilution Buffer可保存于2-8 ℃ 7天，如长时间不用请放置于-20 ℃。

4）为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需震荡混匀1 min以上。

二、加样回收质控QC的制备

根据需要设置QC中的HEK293 DNA加样浓度（以制备加 3 pg/μL DNA量的样本QC为例），具体操作如下：

取100 μL待测样本加入1.5 mL干净的离心管中，再加入10 μL②，混匀，标记为加样回收QC。

加样回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加样回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备（可选）

根据需要设置QC中的HEK293 DNA标准品浓度（以加 3 pg/μL DNA 标准品为例），具体操作如下：

取100 μL 3 pg/μL定量参考品的稀释液加入1.5 mL干净的离心管中，标记为标准品回收QC。

标准品QC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备标准品QC纯化液。

四、阴性质控NC的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

取 100 μL 样本基质溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL干净的离心管中，标记为阴性质控NC。

阴性质控NC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NC纯化液。

五、反应体系

组分	体积（μL）
HEK293 qPCR mix	16
HEK293 Primer&probe mix	4
DNA template	20
总体积	40

【注】1）根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量：qPCR MIX =（反应孔数+2）×40 μL（含有2孔的损失量）。实验中每一个样品模板最好重复做3个以上。

2）加样完成密封好管子后，请先低速离心10 s将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 s以上，完全混匀反应液，再低速离心10 s将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下图为参考板位：

该示例表示的是检测5个浓度梯度的 DNA 标准曲线、1个无模板对照 NTC、3个阴性质控 NC、3个待测样本、3个样本 QC和3个标准品QC。每个检测做3个重复孔。

六、扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

创建1个检测探针，命名为 HEK293-DNA，选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为none。

在Assign target (s) to the selected wells面板中，将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard，并且在Quantity 一栏分别赋值为300000、30000、3000、300、30（含义为每孔的DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，300 fg/μL，30 fg/μL；将无模板对照 NTC 孔的Task一栏设置为NTC；将阴性质控NC孔、待测样本孔、样本QC孔的Task一栏设置为Unknown，并且在相应的Sample Name一栏中命名为NTC、NC、YP、QC，之后点击 。

4. 扩增程序设置：设置反应体积 40 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
扩增产物消化	37 ℃	5 min	1
预变性	95 ℃	10 min	1
变性	95 ℃	15 sec	40
退火/延伸（收集荧光）	60 ℃	60 sec

七、qPCR 结果分析

在 Analysis的Amplification Plot面板中，系统会自动给出Threshold，有时系统给出的Threshold离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节Threshold 至合适位置，点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在Analysis的Standard Curve面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R²、扩增效率（Eff%）。正常的标曲，R²＞0.99；90%≤Eff%≤110%。

3. 在Analysis的View well table面板中，Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本、样本ERC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4. NTC在Threshold=20000时，Ct值应大于32，此时检测值＜5 fg/μL。

 

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