半胱氨酰亚砜裂解酶CSL测试盒

 
半胱氨酰亚砜裂解酶CSL测试盒
微量法
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
半胱氨酰亚砜裂解酶（CSL）广泛存在于百合科葱属(如大蒜和洋葱)，十字花科芸薹属
(如卷心菜，菜花，西兰花)，以及豆科中的合金欢属中，并通常被称为蒜氨酸酶(Alliinase)。香菇酸在γ-谷氨酰转肽酶和半胱氨酸亚砜裂解酶的作用下转化成香菇精，以及产生丙tong酸、乙醛、甲醛和NH3。CSL是内源性甲醛生成的关键酶之一，测定CSL活性对于研究食品安全具有重要意义。

测定原理：
CSL催化S-甲基-L-半胱氨酸亚砜反应产生丙tong酸，与2,4-二硝基ben肼反应，在碱性条件下显棕红色，在510nm下有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：
天平、研钵、离心机、酶标仪、96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。



试剂组成和配制：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×1瓶，4℃避光保存，临用前加入2mL水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存；
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存，临用前加入10mL水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存；
试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂四：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。
试剂五：液体30mL×1瓶，4℃保存。

样本处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，4℃浸提40min。12000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。            

测定操作：

	对照管	测定管
样品（μL）	50	50
试剂一（μL）		25
蒸馏水（μL）	25
试剂二（μL）	25	25
充分混匀，37℃反应20min
试剂三（μL）	100	100
试剂四（μL）	50	50
充分混匀，室温反应5min
试剂五（μL）	250	250
充分混匀，静置5min，吸取200μL至96孔板，测定510nm处吸光值，记为A对照和A测定，△A=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。

半胱氨酰亚砜裂解酶CSL测试盒
计算公式：
标准曲线：y = 0.7313x + 0.0027，R2 = 0.9993；x为标准品浓度：μmol/mL；y为吸光度△A
1.按蛋白含量计算
C-S lyase活性（μmol/min/mg prot）=（△A -0.0027）÷ 0.7313×V样÷(V样×Cpr )÷T=0.068×（△A-0.0027）÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
C-S lyase活性（μmol/min/g 鲜重）=（△A -0.0027）÷ 0.7313×V样÷(V样÷V样总×W )÷T=0.068×（△A-0.0027）÷ W
V样，加入样本上清体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T，反应时间，20min。

注意事项：
1.若测定结果中吸光值超过1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。香菇类样本活性较大，可能需要稀释80-100倍。