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- 脊髓神经元原代培养
- 上海
- 2025年12月27日
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上海达为科生物科技有限公司
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脊髓神经元原代培养
一、实验核心原理与材料选择
1. 实验目的
脊髓神经元原代培养旨在从胚胎或新生哺乳动物脊髓组织中分离出高度分化的神经元细胞，用于研究神经退行性疾病、脊髓损伤修复、药物筛选及神经元发育机制等。其核心优势在于保留神经元在体内的功能特性（如突触可塑性、离子通道活性）。
2. 材料与试剂
| 关键材料 | 技术参数与推荐品牌 |
|---|---|
| 实验动物 | 胚胎期（E13.5-E15.5小鼠或E18大鼠）或新生鼠（出生24小时内），优先选择SPF级SD大鼠或C57BL/6小鼠 |
| 消化酶 | 木瓜蛋白酶（0.2 mg/mL）或胰蛋白酶（0.05%-0.25%），木瓜酶对神经元损伤更小 |
| 培养基 | Neurobasal（含2% B27、0.5 mM L-谷氨酰胺、25 μM β-巯基乙醇）或DMEM/F12（含5%-10% FBS） |
| 包被基质 | 聚-L-赖氨酸（PLL，0.1 mg/mL）或聚-D-赖氨酸（PDL），需提前4℃包被过夜 |
| 抑制胶质细胞 | 阿糖胞苷（5 μM）或氟尿苷（10 μM），于培养第3-5天加入以抑制胶质细胞增殖 |
二、标准化操作流程
1. 取材与预处理
- 动物处死：
- 新生鼠颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡5分钟消毒；孕鼠需麻醉后剖宫取胎。
- 脊髓暴露：
- 沿脊柱背侧中线剪开椎管，剔除脊膜及血管（解剖显微镜下操作），分离完整脊髓组织。
- 组织处理：
- 将脊髓剪碎至1-2 mm³碎片，置于预冷的无Ca²⁺/Mg²⁺ HBSS中漂洗3次。
2. 酶消化与细胞分散
| 步骤 | 操作要点 | 关键参数 |
|---|---|---|
| 酶解处理 | 加入木瓜蛋白酶（含0.1 mg/mL DNase I），37℃振荡消化20-30分钟 | 每5分钟轻摇混匀，避免组织沉淀 |
| 终止消化 | 加入含10% FBS的DMEM终止反应，离心（800 rpm，5分钟）弃上清 | 消化过度会导致细胞碎片增多，显微镜下观察组织呈云雾状时立即终止 |
| 机械分散 | 用火焰抛光的玻璃吸管轻柔吹打20-30次，通过200目尼龙网过滤 | 避免气泡产生，吹打力度过大易损伤神经元轴突 |
3. 细胞接种与培养
- 包被预处理：
- PLL包被培养皿（24孔板：0.5 mL/孔；6孔板：2 mL/孔），37℃孵育1小时后PBS冲洗3次。
- 细胞悬液制备：
- 台盼蓝染色计数，调整密度至5×10⁵~1×10⁶ cells/mL，接种于预包被的培养皿。
- 培养条件：
- 37℃、5% CO₂、95%湿度，前48小时静置培养避免震动。
- 换液策略：
- 初始换液：接种24小时后全量更换培养基以去除死细胞。
- 后续维护：每2-3天半量换液，第4天加入阿糖胞苷抑制非神经元细胞。
4. 传代与冻存
- 传代条件：
- 神经元原代传代能力有限（通常≤2代），推荐直接使用原代细胞进行实验。
- 使用0.125%胰酶+0.02% EDTA消化2-3分钟，含血清培养基终止。
- 冻存方法：
- 细胞悬液与冻存液（含10% DMSO的FBS）按1:1混合，程序降温至-80℃后转液氮保存。
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文献和实验序言：国内外关于原代培养有很多文献，不幸的是，没有一篇是详细的，没有一篇解答过why。 为了让大家少走弯路，根据我杀过3000只老鼠的经验，我把我这几年摸索的经验和大家分享，相信你follow我的这篇文章一定会做的很好。 我的标题说的很像吹牛，但是我是严肃认真的说的，I earn it。 note:这篇文章全是我个人的经验，99.9%原创，经过无数失败的到的最完美的原代神经元培养法。 1. 材料选择 一定要严格按照国际上，NCBI数据库，其他文献
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。孕雌鼠麻醉然后解剖，胎儿收集到HBSS-1中然后快速断头。剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集入HBSS-2 液中机械磨碎。皮质碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中37°C消化15分钟。胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/mL庆大霉素）。以1×105cell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°
rpm离心5 min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；12小时内禁止晃动 6、换液：接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3 d半量换液。 此外，原代培养的海马组织由多种细胞构成，如成纤维
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