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- 2025年12月09日
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- 详细信息
- 技术资料
- 提供商：
上海达为科生物科技有限公司
- 服务名称：
大鼠神经元原代培养
一、实验设计框架
1. 动物与取材选择
- 动物品系：优先选用SD或Wistar大鼠，新生鼠（出生24小时内）或胚胎鼠（E17-18天）。
- 取材区域：根据研究目标选择特定脑区：
- 海马神经元：适用于学习记忆研究，需精细分离海马组织。
- 皮层神经元：适合突触可塑性研究，建议取大脑表层2-3 mm皮质以提高纯度。
- 小脑颗粒神经元：推荐使用新生SD大鼠，需彻底去除脑膜。
2. 培养基与试剂优化
| 成分 | 推荐配方 | 功能说明 |
|---|---|---|
| 基础培养基 | Neurobasal-A（Gibco）或DMEM-F12 | 无血清配方，减少胶质细胞增殖 |
| 添加剂 | B27 Supplement（2%）、L-谷氨酰胺（2 mM）、bing酮酸钠（1 mM） | 支持神经元存活与分化 |
| 抗增殖剂 | 阿糖胞苷（Ara-C，10 μM） | 抑制胶质细胞污染，需在DIV3处理24小时 |
| 包被基质 | 多聚赖氨酸（0.1 mg/mL，PBS溶解） | 增强神经元贴壁，包被1小时后冲洗 |
3. 酶消化策略对比
| 方法 | 优点 | 缺点 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| 木瓜酶+DNA酶 | 温和消化，细胞损伤小，纯度>90% | 消化时间较长（30-45分钟） | 海马/皮层神经元 |
| 胰蛋白酶 | 快速（10-15分钟） | 易导致DNA缠结，需严格控制时间 | 需高通量处理时 |
| 机械吹打结合酶消化 | 提高细胞产量，减少杂质 | 操作技术要求高 | 高纯度需求实验 |
二、标准化操作流程
1. 组织处理与消化
- 解剖取材：
- 75%乙醇消毒动物头部，断头取脑，置于预冷Hanks液中。
- 精细分离目标脑区（如海马或皮层），去除血管和脑膜。
- 组织消化：
- 将组织剪碎至1 mm³碎片，加入含木瓜酶（2 mg/mL）和DNA酶（100 μg/mL）的消化液，37℃水浴30分钟。
- 每10分钟轻柔吹打一次，避免产生气泡。
2. 细胞悬液制备
- 终止消化：加入含10% FBS的DMEM-F12终止反应，200×g离心5分钟。
- 梯度纯化（可选）：
- 使用Nycoprep™ 1.077密度梯度液，800×g离心15分钟，收集界面层神经元。
- 细胞计数：锥虫蓝染色评估活率（需>90%），调整密度至1-5×10⁵ cells/mL。
3. 接种与培养
- 包被处理：培养皿/玻片用0.1 mg/mL多聚赖氨酸包被1小时，PBS冲洗3次。
- 接种密度：
- 常规实验：1×10⁵ cells/cm²（如24孔板每孔2×10⁵ cells）。
- 单细胞成像：5×10⁴ cells/cm²以减少重叠。
- 换液策略：
- 接种后4-6小时更换为无血清Neurobasal-A+B27培养基，去除未贴壁细胞。
- 此后每2-3天半量换液，维持营养稳定。
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