CRISPR/Cas9 KO稳转单克隆细胞系

搞定 CRISPR/Cas9 系统操作

一般可以得到成功 KO 的细胞系；或者铺到 100 mm dish 里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如 SV589 等，但是挑取的单克隆往往不纯，有时需要重新亚克隆）。 单克隆的鉴定 根据设计，推荐使用酶切鉴定的方法（见设计部分），通量高；如果抗体比较好用，推荐使用 WB 检测蛋白，这种方法最彻底；最末一种方法就是直接测序鉴定，该种方法费时费力费钱，建议设计时尽量避开。 PS: Feng Zhang

CRISPR-Cas9 技术敲除酵母菌 ADE1 基因

选育新方法。而 CRISPR-Cas9 技术的出现，更是极大推动了微生物基因组编辑准确性和效率的提高。【背景】泓迅科技利用 CRISPR-Cas9 技术编辑酵母菌中的一个 920bp 的 ADE1 基因。ADE1 是腺嘌呤合成相关基因，如果 ADE1 失活，则细胞将会积累红色色素，呈现红色菌落。【方法】1、质粒构建2、sgRNA 活性检测3、挑选活性较高的 sgRNA 进行基因组定点编辑4、利用基因功能变化、表性变化和测序等方法检测基因定点修饰结果。【结论】1、从颜色表型变化得知，酵母菌落变成红色菌落，可知 ADE

CRISPR-Cas9 基因敲除 sgRNA 设计

以最火热的 p53 为例Step1 先找 p53 基因序列1. NCBI--输入 p53 并选择物种 human：tumor protein p53 [Homo sapiens (human)]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene2. Ctrl+F，输入 sequence，快速定位（当然其实拉下去就是了），点击 Genebank3. 下载 p53 基因序列4. 用 SnapGene 软件打开序列，并简单了解每个元件最好是可以学一下 SnapGene 这个软件的使用