由于NED, VIC,PET等荧光素的专利归Perkin Elmer公司所有,所以我们推荐以下可替代的荧光素:
Dye Excitation Emission
VIC 538 554
HEX 535 556
NED 553 575
TAMRA 556 580
PET 558 595
RedmondRED 579 595
LIZ 638 655
CY5 646 662
TexasRed 583 603
Cy3.5 588 604
ROX 586 610
Cy3.5 588 604
实验中常用的淬灭基团
使用无荧光的淬灭基团可以提高实时定量PCR、多重PCR、FRET实验中的灵敏度。
Dabcyl – Dark Quencher 400–550 nm
分子信标推荐使用Dabcyl淬灭基团。它在抑制蓝色至绿色发射光谱的各种荧光染料时非常有效,但是不适合淬灭发射光谱大于480nm的荧光素。
淬灭范围: 400-550 nm
最大吸光值:453 nm
摩尔消光系数:32.000 M−1 cm−1
分子量:399.2 g/mol
BHQ1 – Dark Quencher 480-580 nm
BHQ1是Biosearch Technologies公司的黑洞淬灭基团之一,对于双标探针、分子信标和FRET探针非常有效,对绿色至黑色发射光谱中的所有染料都有极好的光谱重叠效应。
淬灭范围: 480-580 nm
最大吸光值:534 nm
摩尔消光系数:34.000 M−1 cm−1
分子量:491.5 g/mol
BHQ2 – Dark Quencher 520-650 nm
BHQ2 是Biosearch Technologies 公司的第二个黑洞淬灭基团。BHQ2能高效应用于5’端带荧光的双标探针、分子信标和FRET探针,有效发射光谱是由深绿色至橙色。
淬灭范围: 520-600 nm
最大吸光值:544 nm
摩尔消光系数 91.000 M−1 cm−1
分子量:493.5 g/mol
TAMRA – Fluorescent Quencher 520-600 nm
TAMRA (Tetramethylrhodamin)是一种可以用作双标探针及分子信标的3’端和内部淬灭基团(TAMRA-dT)的荧光染料。它的淬灭范围适合5’端的报告基团,如FAM, HEX, TET, JOE, Yakima Yellow, Cy3 或者其他这个波长范围内的染料。在多重PCR中不推荐使用TAMRA,因为它的荧光特性将使淬灭基团和报告基团光谱发生重叠,增加背景干扰。
淬灭范围: 520-600 nm
最大吸光值: 544nm
摩尔消光系数: 91.000 M−1 cm−1
分子量: 612.7 g/mol
双标探针和5’核酸酶试验引物的设计准则
双标探针 (荧光淬灭探针或称FQ探针) 在其5’端和3’端分别有一个荧光报告和淬灭基团。利用Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性,这些探针可以用于定量PCR体系。靶序列的特异性探针和特异性的PCR引物同时使用,设计的该探针在上下游PCR引物的范围内退火。在PCR的延伸阶段,Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着PCR循环数的增加,游离报告基团的数量不断的增加,实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号,从而对靶序列进行定量分析。
在设计这些双标探针的时候需要谨记以下几个要点。
1、探针的结合位置很重要,先设计好探针再设计PCR引物。
2、探针的结合位点应该靠近扩增产物的中心,扩增产物的长度应该在50-150bp之间。
3、探针的解链温度应该在68℃至70℃之间。
4、探针的长度最少20bp,否则容易发生非特异性结合。
5、尽量避免在探针的5’端出现dG ,因为dG 是一个较弱的淬灭剂,任何dG 都要离5’端至少两个碱基。
探针的设计标准:
G-C 含量::30~80%
多聚碱基::避免出现多个重复碱基,特别是4个或者多于4个G。
末端构成::在末端不能出现G。
退火温度::68-70℃
DNA链:挑选C多余G的链。如果使用互补链,确保C不存在于3’端。
长度::少于30个碱基。
设计:淬灭基团在3’端,荧光染料在5’端。
引物的设计标准:
G-C含量:30-80%
多聚碱基:避免出现多个重复碱基,特别是4个或者多于4个G
末端组成:3’端的5个碱基中不能多于两个G或者C,建议A出现在3’端,便于引物二聚体更加高效的降解。
退火温度::58-60℃
产物: 50-150 个碱基
设计:在设计完探针之后再设计引物,尽量紧靠探针但是不要发生重叠。其中的一条引物可以和外显子交接,用于扩增mRNA。
分子信标的设计原则:
分子信标的5’端和3’端也分别有一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当荧光染料和淬灭基团接近的时候,探针会形成一个发夹结构。在PCR中,分子信标是特别针对目的基因设计的,分子信标探针可以使PCR引物退火。在PCR的退火阶段,探针和它对应的靶序列杂交,发夹环解开后,荧光报告基团和淬灭基团分离,可以发出一个荧光信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比,通过实时监测这个信号,可以对靶序列进行定量。为了精确检测PCR过程,分子信标必须和它们的靶序列在退火阶段杂交成功,而游离的分子信标应该继续保持封闭状态,不会发出任何荧光。通过适当选择探针的长度和靶序列的长度,当温度高于退火温度7-10℃时,探针能够从靶序列上脱离下来,这样的探针序列的长度就很适宜。探针与靶序列的解链温度可以用“GC百分比”原则预测,很多设计探针的软件包都使用这个原则。在添加茎环区序列之前,这个预测方法只能用在探针序列的设计上。实际应用中,探针序列的长度范围通常是15-30个核苷酸。
上图显示的是分子信标在实时定量PCR中的应用原理
A:不和靶序列结合的时候,分子信标呈现发夹结构。荧光报告基团和淬灭基团的紧密结合阻止了报告基团释放荧光。
B:在PCR的退火阶段,分子信标和靶序列杂交结合,将荧光染料和淬灭基团分离,导致荧光染料释放信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比,实时监测荧光信号可以对靶序列进行定量。
•茎环区的解链温度比退火温度高7~10℃
•探针的环状区需要15~30碱基
•茎环区的两边长度应该在5~7 碱基之间
•扩增产物的长度少于150 bp
本文章由
北京赛百盛基因技术有限公司提供。