虽然TdT不能用RNA作为底物,但RNA的存在能够抑制酶活性,在添加0.01mg这么少的RNA,就能够导致加尾寡聚核苷酸数量较少和加上的核苷酸数目减少。用RNase T1在加入TdT前,先处理反应混合物,能够充分地减少RNA的抑制影响。
RNA的抑制影响可以在当5′RACE完成后看到(图6),在加尾反应中RNA数量的增加,结果导致5′RACE扩增产物的减少。在对照反应中,RNA的添加,并不影响用两个基因特异性引物对cDNA的扩增。可以在纯化和加尾前,用RNase H/RNase T1混合物处理cDNA/RNA混合物,来除掉RNA的抑制影响。
图6 RNA对TdT加尾和5'RACE的影响。A图. RNA对加尾的抑制作用。dC加尾反应液中包含1×107个拷贝的纯化923个碱基的cDNA,显示了用TdT加尾,并根据5'RACE系统进行扩增的Hela总RNA的数量。B图.用RNase混合物消化带有异源RNA的cDNA提高5'RACE的效率。样品包含2×106个拷贝的923个碱基的cDNA和1µg Hela总RNA,用RNase H和RNase T1(带1)或不和RNase T1(带2)一起37℃培育30分钟,cDNA样品按照5'RACE系统版本2所描述的来纯化和扩增,每个PCR产物的十分之一在1.5%琼脂糖上,用0.5倍TBE,带有0.5mµg/ml溴化乙锭凝胶电泳分析。
用于加尾反应的TdT的数量和纯度也是非常重要的,太多的TdT会导致5′RACE产物量很少,另外TdT的不同制备方法,经常包含DNA结合活性和其它污染,这些可能并不影响加尾,但是会影响随后的PCR反应,从而导致5′RACE反应失败。为了减少这种可变性,在5′RACE版本2中使用的TdT是高度纯化的重组牛TdT。
3′末端的双链结构和发卡结构,都会通过减少加尾所需要的3′-OH的有效性,从而可以明显地削弱cDNA的均聚加尾作用。5′RACE手册中在加尾前,带有一个重要的退火程序(94℃,1到2分钟),可以破坏cDNA的二级结构。必需立即放到冰上冷却,并保持反应混合物变冷,直到加入TdT为止,这能够有助于保持3′末端退火。存在cDNA的二级结构的可能性和cDNA长度成正比。在加尾反应中,添加助溶剂DMSO有助于增加cDNA的加尾效率,特别是长cDNA,这种DMSO的作用,推测认为是因为DMSO会破坏DNA的二级结构。重组TdT可以耐受DMSO的浓度高达20%,在这项研究中,5.4kb的TSC-2 cDNA的有效加尾和5′RACE(图4)需要添加10%的DMSO到加尾反应中去,而2.8kb的TSC-2 cDNA(图3)和APC产物(图2)可以很容易加尾和扩增,不需另外添加DMSO。
当在5′RACE中使用DMSO时,应该考虑DMSO对随后的PCR的影响,在这项研究中,用于扩增的少量加尾反应物(50ml PCR体系中加1ml),能够使所用的DNA聚合酶的任何潜在的抑制作用最小化,如果目标cDNA的有效加尾,需要DMSO,加尾的cDNA在扩增前,通过纯化,去掉DMSO,可以消除任何潜在的对PCR抑制作用。
结论
这项研究结果显示了用SUPERSCRIPTTM合成长的cDNA第一链的能力和在cDNA 3′末端加上多聚dC尾巴的有效性。这些数据从总体上指出了长5′RACE的主要障碍是依靠PCR的特异性和有效性。这些对于获得长cDNA 5′末端的重要要求,突出了需要有效引物设计,优化PCR,和包含初步PCR的Southern斑点杂交分析以及用巢式基因特异引物重新扩增选定大小的全长产物的一个系统实验策略。在这项研究中,在5′RACE时,用ELONGASE酶混合物进行PCR,使得扩增产物大于2.5kb,并比一般使用的Taq DNA聚合酶对5′RACE产物扩增更有效。