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TSC-2 5'末端的扩增
我们通过分离更长的TSC-2 5'末端来检测5'RACE的性能,使用2.8kb长的cDNA,利用不同的引物和AAP一起分别进行扩增反应(初步PCR),图3显示2个最大的片段,通过凝胶电泳分析初步PCR产物显示每个反应都得到了很多扩增片段,其中最大的对应着所用引物5'RACE产物所期望的大小,所期望大小的TSC-2通过用Southern斑点杂交确证(数据没有显示),选定大小的DNA片段用TSC-2特异巢式引物来重新扩增,获得了每个GSP所对应期望大小的特异的DNA片段,当TSC-2初步PCR产物仅仅稀释后(与APC基因一样),用作巢式PCR,得到了更小的全长产物(数据没有显示)。
图3 TSC-2 5'末端的扩增。用引物TSC-2-2821 GSP反转录1mg Hela总RNA得到TSC-2 mRNA,用引物TSC-2-2657(A带)或引物TSC-2-2441(B带)和AAP一起,用ELONGASE酶混合物以图2方式扩增。初步PCR用琼脂糖电泳分离,选定一定大小的凝胶抽提,并分别用引物TSC-2-2441(A带)或引物TSC-2-1902(B带)和AUAP重新扩增(和上述一样30个循环),每个巢式PCR产物取10µl 在0.8%琼脂糖上,0.5倍TBE凝胶电泳和溴化乙锭染色。
在TSC-2的另外一个实验中,使用了一个对应位置5472的反义引物来合成cDNA第一链,开始的时候,我们使用了几个GSP和锚定引物扩增这个更长的cDNA产物,来得到5'末端序列,但是没有成功。用各个GSP和5'末端正义GSP一起,进行RT-PCR,得到了全长cDNA(数据没有显示),用引物5472最后获得成功的一个主要因素是加尾条件,在加尾反应中,加入10%DMSO,作为助溶剂,来完成5'RACE(图4)。残留的少量DMSO(终浓度为0.2%)不影响PCR。
图4 TSC-2 cDNA的长5'RACE。初步PCR产物(带1和带3)和巢式PCR产物(带2和带4)的琼脂糖凝胶分析。用5µg Hela总RNA,引物TSC-2-5472,45℃完成cDNA合成,dC加尾反应用了10µl GLASSMAX纯化的cDNA,并包含10%的DMSO,用1µl 加尾反应产物直接PCR扩增[94℃ 30s,接着40个循环的94℃ 15 s,65℃ 20 s,68℃ 5 min],其中使用了1单位的ELONGASE酶混合物[PCR 50ml终体积,其中60 mM Tris-SO4(pH9.1),18 mM (NH4)2SO4,2 mM MgSO4,dNTP每个200 µM,引物每个400 nM ],其中分别是AAP和引物TSC-2-2826(A带)或引物TSC-2-1732(B带)一起使用。每个PCR产物(带1和带3)取10µl 在0.8%琼脂糖上,1倍TAE凝胶电泳和SYBRò绿染色(分子探针),再用Hitachi FM-BioTM荧光成像仪(505-nm滤镜)成像。SYBRò绿和成像仪一起提供低背景,但分辨率和溴化乙锭染色相似的凝胶分析。用于巢式PCR的大小选定的材料来自2.83 kb或1.73 kb的带,分别取5到10µl的凝胶回收,每个回收胶中加50 µl TE缓冲液,65℃培育10分钟来洗脱出DNA,用1µl大小选定的PCR产物进行30个循环的巢式PCR(带2和带4)。
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