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这里应该指出的是可以扩增到的最大的TSC-2 5'末端片段是2.83kb,其它对应更大片段的引物(在TSC-2中位置5161,5089,和4535)没有能得到特异的5'RACE产物,甚至使用一系列的巢式PCR引物和锚定引物也没能成功。然而,用5'RACE巢式扩增相同大小的材料,以两个GSP来进行RT-PCR,可以很容易获得TSC-2特异性PCR产物,说明存在更长片段的TSC-2特异产物。通过5'RACE获得的产物如此复杂,一个可能的原因是能够用于成功扩增的产物长度有限。由于所有的3'末端都加了尾,以及异源PCR产物的存在,降低了扩增全长5'末端产物的效率(图4)。
比较ELONGASE酶混合物和Taq DNA聚合酶 ELONGASE酶混合物能够扩增TSC-2的2.83kb片段,而Taq DNA聚合酶只能扩增到1.73kb片段(图5),对于1.73kb的片段,ELONGASE酶混合物得到的扩增产量明显更多。
图5比较Taq DNA聚合酶和ELONGASE酶混合物。 人TSC-2的长5'RACE以图4所示来完成,取1µl dC加尾反应产物分别用ELONGASE酶混合物(带2)或1单位的Taq DNA聚合酶(带1)[PCR 50ml终体积,其中20 mM Tris-HCl(pH8.4),50 mM KCl,1.5 mM MgCl2,dNTP每个200 µM,引物每个400 nM ]进行扩增,其中分别是AAP和引物TSC-2-2826(A带)或引物TSC-2-1732(B带)一起使用。
优化5′RACE的TdT加尾条件 发现有几个因素影响cDNA 3′末端加尾效率:1)RNA的存在抑制TdT;2)缓冲液成分和反应条件;3)TdT的数量和纯度;和4)cDNA 3′末端的二级结构。
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