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细胞凋亡检测实验

标签: 细胞 细胞凋亡 检测

细胞凋亡检测可以:(1)用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究;(2)应用于临床诊疗,新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治疗;(3)对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。

详细
实验方法
  • 荧光探针双标记法
  • 形态学检测法
  • DNA ladder法
  • Annexin V/PI双染色法
  • 磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)
  • TUNEL法
  • Caspase-3活性检测法
实验方法原理
本实验用1μg/ml 三尖杉酯碱HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。

三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。
 
细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质,可跨膜进入活细胞,因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T)碱基区),显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、试剂准备
 
1.  三尖杉酯碱(HT):300μg/ml;

2.  Tris-HCl(pH7.5):100mmol/L;

3.  EDTA缓冲液:5mol/L;

4.   碱性裂解液:0.2mol/L NaOH;

5.  醋酸钠:3mol/L KAc(pH4.8);

6.  PI母液:500μg/ml;

7.  Ho33342母液:2mmol/L;

8.  人早幼粒白血病HL-60细胞:用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃,5% CO2条件下培养。

9.  其他:异丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚蓝、蔗糖指示剂、TBE电泳缓冲液、1%琼脂糖、溴乙锭。
 
 
二、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡
 
1.  实验前约24小时,接种两瓶HL-60细胞,标记①、②,每瓶含约6 ml培养液,置37℃,5%CO2培养箱培养。
 
2.  实验前约2.5小时,当细胞密度达到70%,①号瓶加入三尖杉酯碱200 μl,使终浓度为1 μg/ml,②号瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。
 
3.  Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞
 
(1)染色:将瓶中的细胞摇匀取200 μl于1.5 ml的离心管中,加入Ho33342母液2 μl,PI 20 μl,染色15分钟。
 
(2)滴片:取一载玻片用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10 μl,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察,区别三种细胞,并注意三者比例。
 
 
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注意事项
 
1.  诱导培养HL-60细胞时间要准确;
 
2.  荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。
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其他
细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
 
在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。
 
在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。
 
相比之下,坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。
 
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。
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实验方法原理 根据凋亡细胞固有的形态特征,使用合适的显微镜检测凋亡细胞形态变化。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、光学显微镜和倒置显微镜
 
1.   未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
 
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
 
2.   染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割
 
成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
 
二、 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
 
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
 
常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
 
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1 mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释,终浓度为10 ug/ml。
 
DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1 mg/ml的浓度,使用终浓度一般为10 ug/ml。
 
结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。
 
 
三、 透射电子显微镜观察
 
结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
 
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实验方法原理
发生细胞凋亡时,内源性核酸酶被激活,染色体DNA链在核小体之间被切割,形成180~200个碱基或其整数倍的DNA片段,将这些DNA片段抽提出来进行电泳,可得到DNA梯状条带(DNA ladder)。
 
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、材料与试剂准备
 
1.  材料:凋亡细胞。
 
2.  蛋白酶K(500 μg/ml), 醋酸钾氯仿(8 mol/L),无水乙醇,70%乙醇,2%琼脂糖凝胶。
 
3.  白细胞裂解液:pH8.0,10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA,1% SDS。
 
二、操作步骤
 
1.  收集凋亡细胞:取1~2×106 个细胞,离心后,立即用70%酒精(-20℃)固定2 h。
 
2.  洗涤:取出酒精固定的细胞,1 000 r/min离心5 min ,去掉上清液,PBS洗二次。
 
3.  裂解细胞:加400 μl细胞裂解液,充分混匀再加蛋白酶K 100 μl,置65℃水浴消化2小时或过夜。
 
4.  蛋白处理:加75 μl 8 mol/L的醋酸钾,4℃15 min,再加750 μl氯仿,充分混匀后,10 000 r/min离心10 min后,将上清移至一新的Eppendorf管中。
 
5.  沉淀DNA:加入750μl无水乙醇,上下轻柔颠倒混合,即可见乳白色沉淀,若不明显时可置-20℃过夜,12 000 r/min离心10 min,去上清。
 
6.  洗涤DNA:加1 ml 70%乙醇,混匀,10 000 r/min 离心5 min,去上清。
 
7.  溶解DNA:根据 DAN 沉淀的大小,加一定量的蒸馏水或TE,37℃溶解。
 
8.  测定DNA浓度。
 
9.  2%琼脂糖凝胶电泳80 V 2小时。
 
三、结果判断
 
出现梯状电泳条带,最小的条带为180~200 bp,其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带,无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大,迁移距离短,故停留在加样孔附近。
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实验方法原理 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。

Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。

PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、试剂与仪器
 
1.  孵育缓冲液:10 mmol/L HEPES/NaOH,pH7.4,140 mmol/L NaCl,5 mmol/L CaCl2
 
2.  标记液:将FITC- Annexin V(宝灵曼公司产品)和PI加入到孵育缓冲液中,终浓度均为1 ug/ml。
 
3.  流式细胞仪。
 
二、实验步骤
 
1.  细胞收集:悬浮细胞直接收集到10 ml的离心管中,每样本细胞数为(1~5)×106/mL 500~1 000 r/min离心5 min,弃去培养液。
 
2.  用孵育缓冲液洗涤1次,500~1 000 r/min离心5 min。
 
3.  用100 ul的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育10~15 min。
 
4.  500~1 000 r/min离心5 min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
 
5.  加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20 min,避光并不时振动。
 
6.  流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用488 nm,用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560 nm的滤器检测PI。
 
7.  结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。
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实验方法原理
磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
 

 
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
实验步骤
一、悬浮细胞的染色

将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次,加入100 ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20 ug/ml)10 ul,室温避光30 min,再加入PI(50 ug/ml)5 ul,避光反应5 min后,加入400 ul Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h), 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
 
二、贴壁培养的细胞染色

先用0.25%的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。

三、 爬片细胞染色

同上,最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
 
四、结果 
 

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注意事项
1.  整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。
 
2.  操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。
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实验方法原理
脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察。
 
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、试剂配制
 
1.  磷酸缓冲液PBS(pH7.4):磷酸钠盐 50 mM,NaCl 200 mM。
 
2.  蛋白酶K(200 μg/ml,pH7.4):蛋白酶K 0.02 g;PBS 100 ml。
 
3.  含2%H2O2的PBS缓冲液(pH7.4):H2O2 2.0 ml;PBS缓冲液 98.0 ml。
 
4.  TdT酶缓冲液(新鲜配):Trlzma碱 3.63 g用 0.1 N HCl调节pH至 7.2,加ddH2O定容到1 000 ml;再加入二甲砷酸钠 29.96 g和氯化钴0.238 g。
 
5.  TdT酶反应液:TdT酶32 μl;TdT酶缓冲液 76 μl,混匀,置于冰上备用。
 
6.  洗涤与终止反应缓冲液:氯化钠 17. 4 g;柠檬酸钠 8.82 g;ddH2O 1 000 ml。
 
7.  0.05%二氨基联苯(DAB)溶液:DAB 5 mg;PBS 10 ml,pH7.4,临用前过滤后,加过氧化氢至0.02%。
 
8.  0.5%甲基绿(pH4.0):甲基绿0.5 g;0.1 M乙酸钠100 ml。
 
9.  100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等。
 
10.  过氧化物酶标记的抗地高辛抗体(ONCOR)。
 
二、实验步骤
 
1.  标本预处理
 
(1)石蜡包埋的组织切片预处理:将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5 min。用无水乙醇洗两次,每次3 min。用95%和75%乙醇各洗一次,每次3 min。用PBS洗5 min 加入蛋白酶K溶液(20 ug/ml),于室温水解15 min,去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次,每次2 min,然后按下述步骤2进行操作。
 
(2)冰冻组织切片预处理:将冰冻组织切片置10%中性甲醛中,于室温固定10 min后,去除多余液体。用PBS洗两次,每次5 min。置乙醇:乙酸(2:1)的溶液中,于-20℃处理5 min,去除多余液体。用PBS洗两次,每次5 min,然后按下述步骤2进行操作。
 
(3)培养的或从组织分离的细胞的预处理:将约 5 × 107个/ml细胞于 4%中性甲醛室温中固定10 min。在载玻片上滴加 50-100 μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次,每次5 min,然后按下述步骤2进行操作。
 
2.  色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5 min。用PBS洗两次,每次5 min。
 
3.  用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液,置室温1-5 min。
 
4、 用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加 54 μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应 1 h(注意:阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液)。
 
5.  将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30 min,每10 min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动。
 
6.  组织切片用PBS洗3次,每次 5 min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30 min。
 
7.  用PBS洗4次,每次5 min。
 
8.  在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05% DAB溶液,室温显色3-6 min。
 
9.  用蒸馏水洗4次,前3次每次1 min,最后1次5 min。
 
10.  于室温用甲基绿进行复染10 min。用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30 s。依同样方法再用100%正丁醇洗三次。
 
11.  用二甲苯脱水3次,每次2 min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果。
 
 
 
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注意事项
1.  一定要设立阳性和阴性细胞对照。

2.  阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松(1 μM)处理3-4 h的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。

3.  阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同。
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其他
一、TUNEL法简介

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300 kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180-200 bp核小体DNA多聚体。
 
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3'-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)。
 
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译(nick translation),使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞。
 
TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
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实验方法原理 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

 
一、Western blot 分析Procaspase-3的活化,以及活化的Caspase-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等的裂解。
 
1.  方法
 
收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭,室温1.5~2 h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2 h或4°C过夜→TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次,5~10 min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2 h→ TBS-T洗3次, 5~10 min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。
 
2.  结果
 
 

二、 荧光分光光度计分析
 
1.  原理

活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物,水解D4-X肽键。根据这一特点,设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时,AMC不能被激发荧光,短肽被水解后释放出AMC,自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小,可以测定caspase-3的活性,从而反映Caspase-3被活化的程度。
 
2.  方法

收获细胞正常或凋亡细胞→PBS洗涤→制备细胞裂解液→加Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽荧光底物)→37°C反应1 h→荧光分光光度计(Polarstar)分析荧光强度(激发光波长380 nm,发射光波长为430-460 nm)。
 
3.  结果


 
三、流式细胞术分析
 
1.  方法

收获细胞正常或凋亡细胞→PBS洗涤→加Ac-DEVD-AMC→37°C反应1 h→UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。
 
2.  结果

 
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