临床样本分析与代谢组学
评估CRC患者与健康对照的肠道菌群和色氨酸代谢差异。
对83例CRC患者和49例健康对照粪便样本进行宏基因组测序和靶向色氨酸代谢组学分析，比较菌群多样性、组成和代谢物水平。
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吲哚-3-乳酸通过代谢重编程抑制结直肠癌
Indole-3-lactic acid suppresses colorectal cancer via metabolic reprogramming
实验完整度
高包含临床样本测序与代谢组学、AOM/DSS模型、异种移植模型、体外细胞功能实验、转录组学及机制验证（STAT3-HK2轴）。
主要模型
HCT116细胞系 MC38细胞系 AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠模型 MC38细胞异种移植小鼠模型 HCT116细胞裸鼠异种移植模型
重点核对
ILA处理浓度（250μM） ILA给药剂量（400μg/20g/d） ILA给药途径（口服、腹腔注射、皮下注射） CCK8、EdU、Transwell等体外功能实验 AOM/DSS模型中DSS循环次数
摘要
研究表明，肠道菌群代谢异常与结直肠癌（CRC）进展有关，但菌群相关的色氨酸代谢紊乱的作用仍不清楚。通过宏基因组测序和靶向色氨酸代谢组学分析，我们发现CRC患者体内吲哚-3-乳酸（ILA）水平异常，且与肿瘤恶性程度相关。外源性ILA给药抑制了AOM/DSS诱导的和异种移植小鼠模型中的CRC发展。此外，体外实验表明，ILA抑制肿瘤细胞增殖、迁移和抗凋亡能力。机制上，ILA似乎直接占据STAT3的磷酸化位点，导致细胞内磷酸化STAT3（p-STAT3）水平降低，抑制HK2通路，从而下调癌细胞的葡萄糖代谢。值得注意的是，这种抑制不依赖于芳烃受体（AHR）。总之，我们的研究结果表明，CRC患者色氨酸代谢的改变可以影响肿瘤进展，并揭示了ILA发挥抑制CRC作用的新机制。这些发现为肠道菌群在CRC中的作用提供了新见解，并确定了潜在的临床治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CRC患者肠道中色氨酸代谢异常是否影响肿瘤进展，ILA是否通过直接作用于肿瘤细胞发挥抑制作用？
- 核心机制
- ILA直接占据STAT3的SH2结构域，抑制STAT3磷酸化，减少p-STAT3向HK2启动子的募集，从而下调HK2表达，抑制糖酵解途径。
- 主要证据
- CRC患者粪便中ILA水平降低且与肿瘤分期负相关；ILA抑制MC38和HCT116细胞增殖、迁移并诱导凋亡；RNA-seq显示糖酵解基因下调；分子对接及ChIP-qPCR验证ILA抑制STAT3与HK2启动子结合；AHR抑制或敲低不改变ILA效应。
- 研究意义
- 揭示ILA作为肠道菌群代谢物直接抑制CRC的新机制，为CRC治疗提供潜在的临床靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内肿瘤模型评估ILA效果
验证外源性ILA对CRC发展的抑制作用。
在AOM/DSS诱导的CRC模型和MC38、HCT116异种移植模型中给予ILA，评估肿瘤数量、大小、增殖标志物及免疫细胞浸润。
体外细胞功能实验
确认ILA对CRC细胞增殖、迁移和凋亡的直接抑制作用。
用不同浓度ILA处理MC38和HCT116细胞，检测CCK8、EdU、集落形成、Transwell迁移和凋亡。
转录组学与代谢分析
探索ILA对肿瘤细胞代谢的影响。
对ILA处理的HCT116细胞进行RNA-seq，检测糖酵解基因表达、乳酸产生、葡萄糖消耗和ATP水平，并使用Seahorse分析细胞外酸化率。
机制验证：STAT3-HK2轴
验证ILA是否通过STAT3磷酸化调控HK2表达。
通过Western blot检测p-STAT3水平，分子对接预测ILA与STAT3 SH2结构域结合，ChIP-qPCR检测STAT3在HK2启动子的富集，并过表达STAT3验证功能恢复。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | CG0430B | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-aldrich | D2650 | |
| 药物处理 | 吲哚-3-乳酸 | MCE | HY-113099 |
| CH223191 | MCE | HY-12684 | |
| 2-脱氧葡萄糖 | MCE | HY-13966 | |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂盒 | Dojindo Laboratories | CK04 |
| EdU染色试剂盒 | KeyGEN | KGA9602-100 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V FITC/PI凋亡试剂盒 | Vazyme | A211-01 |
| 代谢检测 | 增强型ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 |
| 乳酸检测试剂盒 | KeyGEN | KGA7401-48 | |
| 免疫组化 | 免疫组化试剂盒 | Beyotime | P0603 |
| ChIP | ChIP试剂盒 | BersinBio | Bes5001 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| RT-qPCR | HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | R223-01 |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Vazyme | R411-01-AA |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000001 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 磷酸酶抑制剂 | MCE | HY-K0023 | |
| 蛋白酶抑制剂 | MCE | HY-K0010 | |
| 抗HK2抗体 | ABclone | A0994 | |
| 抗AHR抗体 | ABclone | A22464 | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| 抗p-STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| Seahorse分析 | 安捷伦Seahorse XFe96细胞能量代谢分析仪 | Agilent | -- |
| Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent | 103020-100 | |
| Seahorse XFp线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103010-100 | |
| 流式细胞术 | CytoFlex流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | GemPharmatech | N000013 |
| BALB/c裸鼠 | GemPharmatech | D000521 | |
| 细胞系 | HCT116细胞系 | ATCC | CCL-247 |
| MC38细胞系 | Kerafast | CVCL_B288 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 纳入排除标准：年龄18-80岁、BMI 18.5-25、3个月内未使用抗生素等 阅读提示：详见Methods中Human samples部分 |
| 宏基因组测序 | 测序平台、读长、过滤条件、参考数据库 阅读提示：详见Methods中Metagenomic sequencing部分 |
| 靶向色氨酸代谢组学 | 样本处理、色谱质谱条件 阅读提示：详见Methods中Trp metabolism部分 |
| 动物模型 | 小鼠品系、周龄、性别、ILA给药剂量和途径 阅读提示：详见Methods中In vivo animal studies部分 |
| 细胞培养与处理 | 细胞系、培养基、血清浓度、ILA处理浓度和时间 阅读提示：详见Methods中Cell culture部分 |
| 体外功能实验 | CCK8、EdU、集落形成、Transwell、凋亡的实验条件 阅读提示：详见Methods中Cell growth and proliferation assays、Transwell assay、Flow cytometry analysis部分 |
| 代谢检测 | 葡萄糖、乳酸、ATP检测试剂盒和步骤 阅读提示：详见Methods中Metabolite measurements部分 |
| Seahorse分析 | 细胞接种密度、处理、校准步骤 阅读提示：详见Methods中Seahorse metabolic analysis部分 |
| Western blot | 抗体、稀释比例、蛋白上样量 阅读提示：详见Methods中Western blotting部分及Table 1 |
| ChIP-qPCR | 交联时间、抗体、引物序列 阅读提示：详见Methods中Chromatin immunoprecipitation assay部分 |