建立CTC衍生类器官模型
建立可长期培养的CTC类器官模型，以模拟患者肿瘤特征。
从转移性乳腺癌患者外周血、白细胞分离产物或积液中分离CTC，并在含有NRG1和Y27632的培养基中培养形成类器官。
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循环肿瘤细胞的可塑性通过神经调节蛋白1-HER3信号决定乳腺癌的治疗耐药性
Circulating tumor cell plasticity determines breast cancer therapy resistance via neuregulin 1-HER3 signaling
实验完整度
高建立了CTC类器官模型，结合体外细胞功能实验、体内异种移植和患者样本多组学分析，并通过CRISPR敲除和药物处理进行功能验证。
主要模型
CTC来源类器官（CDOs） 异种移植模型（CDX/EDX） NSG小鼠乳腺癌模型 患者循环肿瘤细胞
重点核对
NRG1和Y27632协同促进CTC类器官生长 ERBB3敲除显著抑制体内肿瘤生长和肺转移 FGFR1过表达可补偿NRG1缺失导致的细胞存活和克隆形成缺陷 联合使用lapatinib和AZD4547在体外和体内均显著抑制肿瘤生长
摘要
循环肿瘤细胞（CTCs）驱动转移，这是乳腺癌患者死亡的主要原因。由于其在循环中丰度低，迫切需要稳健的CTC扩增方案以有效研究疾病进展和治疗反应。在此，我们报告了来自转移性乳腺癌女性患者的长时期CTC衍生类器官的建立。对CTC衍生类器官的多组学分析以及异种移植的临床前模型鉴定出神经调节蛋白1（NRG1）–ERBB2受体酪氨酸激酶3（ERBB3/HER3）信号是CTC存活、生长和播散所需的关键通路。全基因组CRISPR激活筛选揭示，成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）信号对NRG1–HER3轴发挥补偿功能，并在NRG1缺陷的CTC中挽救NRG1缺失。相反，NRG1–HER3激活诱导了对FGFR1抑制的耐药性，而联合阻断则损害CTC生长。NRG1–HER3和FGFR1信号之间的动态相互作用揭示了癌细胞可塑性的分子基础以及靶向它的临床相关策略。我们的CTC类器官平台能够识别和验证患者特异性的脆弱性，并代表了精准医学的创新工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 循环肿瘤细胞如何在体内存活并形成转移，以及其治疗耐药性的分子机制是什么？
- 核心机制
- NRG1–HER3信号通路是CTC存活和转移的关键，而FGFR1信号可补偿NRG1–HER3缺失，两者通过AKT–ERK通路介导可塑性耐药。
- 主要证据
- CTC衍生类器官的转录组分析、功能实验（ERBB3敲除和FGFR1过表达）、体内实验（移植瘤和肺转移模型）以及药物处理实验均支持该机制。
- 研究意义
- 该研究提供了CTC类器官平台，可用于个性化药物筛选和耐药机制研究，并提示联合靶向NRG1–HER3和FGFR1信号可能是一种有效的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
识别NRG1–HER3关键通路
确定CTC生长和转移所需的关键信号通路。
对原发肿瘤和肺转移细胞进行转录组分析，鉴定NRG1信号富集；并通过添加NRG1检测其对CTC生长和信号通路激活的影响。
验证HER3功能
证实HER3对CTC体内外生长和转移的必要性。
使用CRISPR-Cas9敲除ERBB3（KO）或引入非功能性等位基因（NF），评估细胞在体外和体内（乳腺脂肪垫和尾静脉注射）的生长和转移能力。
挖掘补偿通路
寻找可替代NRG1–HER3信号的补偿通路，解释部分CTC的NRG1非依赖性。
利用全基因组CRISPRa筛选鉴定在NRG1缺失条件下能促进细胞存活的基因，发现FGFR1。通过过表达FGFR1验证其对NRG1缺失的补偿作用，并检测FGFR1抑制剂的影响。
联合靶向治疗
验证同时阻断NRG1–HER3和FGFR1信号是否能有效抑制CTC生长。
在多种CDO模型和PDX模型中，单独或联合使用HER2抑制剂lapatinib和FGFR抑制剂AZD4547，评估对细胞活力和肿瘤生长的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | G1培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| G2培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| NRG1 | -- | -- | |
| Y27632 | -- | -- | |
| I型胶原蛋白 | Corning | -- | |
| Accutase | Sigma, Life Technologies | -- | |
| CellSave采血管 | Menarini Silicon Biosystems | -- | |
| Vacutainer CPT采血管 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞分离 | Spectra Optia血细胞分离机 | Terumo BCT | -- |
| MACS微珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-801; 130-050-101; 130-091-935; 130-045-701; 130-050-501 | |
| 流式细胞术 | FACSAria Fusion流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| LSR Fortessa流式细胞分析仪 | BD Biosciences | -- | |
| 抗EpCAM-FITC抗体 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 抗CD45-VioBlue抗体 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 抗HER3-PE抗体 | R&D | FAB3481P | |
| 碘化丙啶 | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| ELISA | 人NRG1 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SpectraMax iD3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 细胞培养 | Primaria培养板 | Corning | -- |
| Breast TumorMACS培养基 | Miltenyi Biotec | -- | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-103-922 | |
| 基因编辑 | pLKO.005载体 | Addgene | -- |
| pCW-Cas9-tGFP质粒 | Addgene | -- | |
| 盐酸多西环素 | -- | -- | |
| 药物处理 | AZD4547 | Selleckchem | S2801 |
| 拉帕替尼 | Selleckchem | S2111 | |
| 他塞利西布 | Selleckchem | S7103 | |
| 阿培利司 | Selleckchem | S2814 | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Blue细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞周期分析 | Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-PE | BD Biosciences | -- |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | BD | -- |
| β-雌二醇缓释片 | Innovative Research of America | -- | |
| IVIS Spectrum Xenogen小动物活体成像系统 | Caliper Life Sciences | -- | |
| RNA提取 | miRNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| PicoPure RNA提取试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| RT-qPCR | High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosciences | -- |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Life Technologies | -- | |
| ViiA-7实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | -- | |
| 抗磷酸化HER3抗体 | Cell Signaling Technology | 4791 | |
| 抗HER3抗体 | Cell Signaling Technology | 12708 | |
| 抗FGFR1抗体 | Cell Signaling Technology | 9740 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗磷酸化FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 8556 | |
| 抗FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 3285 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| 免疫组化 | 抗EpCAM抗体 | Agilent Dako | Ber-EP4 |
| 抗人KRT19抗体 | Agilent Dako | RCK108 | |
| 抗人Ki-67抗体 | Agilent Dako | Ki-67 | |
| 抗ERα抗体 | Thermo Fisher Scientific | SP1 | |
| 抗CDH1抗体 | Agilent Dako | M3612 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Agilent Dako | M7020 | |
| 抗HER3抗体 | Cell Signaling Technology | 12708 | |
| 蔡司AxioScan扫描仪 | Zeiss | -- | |
| 测序 | Ion Torrent AmpliSeq | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Ion S5XL测序仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| NEBNext单细胞/低起始量RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| HiSeq2000测序仪 | Illumina | -- | |
| CRISPRa筛选 | CRISPRa混合文库Set A | Addgene | 92379 |
| pXPR_502载体 | Addgene | 96923 | |
| BsmBI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0739 | |
| lenti dCas9VP64_Blast慢病毒载体 | Addgene | 61425 | |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| Quick-DNA中提试剂盒 | Zymo Research | D4075 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CTC类器官培养基组成 | NRG1浓度（20 ng ml–1）、Y27632浓度（文中未明确说明具体浓度，但指出需单独添加）、其他培养基组分（FGFs、noggin等） 阅读提示：Methods：Long-term in vitro expansion of CTCs；结果部分图1f-h |
| CTC分离和培养 | CTC来源（外周血、DLA、积液）、FACS分选参数（EpCAM+CD45-）、培养条件（5% O2） 阅读提示：Methods：FACS and flow cytometry；Long-term in vitro expansion of CTCs |
| ERBB3基因敲除 | gRNA序列、质粒载体（pLKO.005）、病毒包装系统（psPAX2, pMD2.G）、感染和筛选流程、多西环素诱导浓度和时间 阅读提示：Methods：CRISPR–Cas9-mediated ERBB3 KO；Extended Data Fig. 7 |
| 体内实验 | 小鼠品系（NSG）、细胞注射数量（1×10^6 或 1×10^5）、注射途径（乳腺脂肪垫或尾静脉）、Matrigel使用、药物剂量（lapatinib 100 mg/kg, AZD4547 10 mg/kg） 阅读提示：Methods：Mouse studies；In vivo drug treatments |
| CRISPRa筛选 | 文库（Calabrese CRISPRa文库）、感染复数、细胞数量、筛选时间点（t1, t2）、gRNA分析方法 阅读提示：Methods：Genome-wide CRISPRa screen |