内皮特异性Lats2敲除小鼠模型建立
探究内皮细胞中Lats2缺失对骨髓稳态的影响
通过Cdh5-CreERT2介导的Lats2条件性敲除，他莫昔芬诱导后分析12周龄小鼠
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内皮LATS2是骨髓纤维化的抑制因子
Endothelial LATS2 is a suppressor of bone marrow fibrosis
实验完整度
高包含EC特异性基因敲除小鼠模型、YAP1过表达及SRF敲除回补实验、单细胞RNA测序、组织学染色、μCT、体外BMSC处理等，涵盖分子、细胞、组织及体内多层级验证。
主要模型
Lats2iΔEC小鼠（内皮特异性Lats2敲除） YapKIiEC小鼠（内皮特异性YAP1S112A敲入） Lats2 SrfiΔEC小鼠（内皮特异性Lats2和Srf双敲除） ThPO和MPLW515L诱导的骨髓纤维化小鼠模型
重点核对
内皮特异性Lats2敲除（Cdh5-CreERT2）及他莫昔芬诱导方案（4-5周龄，连续5天腹腔注射1mg） YAP1/TAZ蛋白表达水平及核定位（免疫荧光检测） SRF在Lats2iΔEC mpECs中的表达变化（RNA和蛋白水平） Srf敲除对Lats2iΔEC表型的拯救效果（血管结构、纤维化标志物、骨量） scRNA-seq细胞类型鉴定及差异基因分析（EC、BMSC、CHO、SMC等）
摘要
骨髓纤维化和骨质硬化是破坏骨髓功能的纤维化疾病，发生在各种白血病中，也响应于造血细胞的非恶性改变。在这里，我们表明内皮细胞特异性失活编码Hippo激酶大肿瘤抑制激酶2的Lats2基因，或过表达下游效应分子YAP1，可诱导肌成纤维细胞形成，并导致广泛的纤维化和骨质硬化，损害骨髓功能并引起脾脏中的髓外造血。机制上，LATS2缺失诱导内皮-间质转化，导致细胞外基质和分泌信号分子表达增加。内皮细胞的变化涉及血清反应因子靶基因表达增加，并且显著的是，LATS2突变表型的主要方面可通过失活Srf基因得以拯救。这些发现将内皮细胞确定为骨髓纤维化的驱动因素，增进了对骨髓纤维化和骨质硬化疾病的理解，目前这些疾病缺乏药物治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内皮细胞中Lats2缺失是否以及如何导致骨髓纤维化和骨质硬化？
- 核心机制
- 内皮细胞Lats2缺失导致YAP1/TAZ活性增加，通过上调血清反应因子（SRF）诱导内皮-间质转化（EndMT），促进细胞外基质和分泌因子表达，进而驱动骨髓纤维化和骨质硬化。
- 主要证据
- Lats2iΔEC小鼠出现血管异常、纤维化和骨质硬化，YapKIiEC小鼠表型相似，而Lats2 SrfiΔEC双敲除可逆转大部分表型；scRNA-seq显示mpECs中SRF靶基因上调，且EndMT相关基因表达增加。
- 研究意义
- 研究揭示内皮细胞是骨髓纤维化的驱动因素，为理解骨髓纤维化和骨质硬化疾病提供了新机制，可能为缺乏药物治疗的这些疾病提供新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
骨血管形态和纤维化表型分析
确认Lats2缺失是否导致血管异常和纤维化
通过免疫荧光、组织学染色（Safranin O、AZAN、网织纤维）和透射电镜分析骨切片
骨髓造血功能和髓外造血评估
检测骨髓纤维化是否影响造血功能并导致髓外造血
通过血细胞计数、FACS分析骨髓和脾脏细胞群，组织学观察脾脏红白髓比例
单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析
全面解析Lats2缺失后骨髓基质细胞异质性和细胞间通讯变化
从股骨和胫骨分离非造血基质细胞，进行10x Chromium单细胞转录组测序，分析细胞亚群及差异基因
机制验证实验
验证YAP1/TAZ和SRF在Lats2缺失诱导的EndMT和纤维化中的作用
生成Yap1/Taz双敲除（Yap1/TaziΔEC）、YAP1稳定过表达（YapKIiEC）以及Lats2/Srf双敲除（Lats2 SrfiΔEC）小鼠，分析骨表型
体外细胞实验验证分泌因子作用
验证EC衍生的分泌因子是否直接诱导BMSC向肌成纤维细胞分化
体外培养野生型BMSC，分别用TGFβ1、内皮素1（ET1）或肾上腺髓质素（ADM）处理24小时，通过qPCR检测肌成纤维细胞标志物表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 模型构建 | 他莫昔芬 | -- | -- |
| 免疫染色 | 抗内皮粘蛋白抗体（V.7C7） | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 |
| 抗CD31抗体 | R&D Systems | AF3628 | |
| 抗PDGFRβ抗体 | R&D Systems | AF1042 | |
| α-SMA-Cy3抗体 | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| α-SMA-eFluor660抗体 | eBioscience | 50-9760-82 | |
| 抗YAP1/TAZ抗体（D24E4） | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| 抗波形蛋白抗体（D21H3） | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| 抗Tagln（SM22α）抗体 | Abcam | ab14106 | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| 抗血小板反应蛋白1抗体 | Abcam | ab85762 | |
| 抗血管生成素2抗体 | Abcam | ab8452 | |
| 抗小窝蛋白1抗体 | Cell Signaling Technology | 3238 | |
| 抗IV型胶原抗体 | AbD Serotec | 2150-1470 | |
| 抗Osterix抗体 | Abcam | ab22552 | |
| 抗MMP9抗体 | R&D Systems | AF909 | |
| 抗I型胶原抗体 | Millipore | AB765P | |
| 抗X型胶原抗体 | Abcam | ab58632 | |
| 抗LATS2抗体 | GeneTex | GTX87529 | |
| 抗聚集蛋白聚糖抗体 | Millipore | AB1031 | |
| 抗vATPaseB1/B2抗体 | Abcam | 200839 | |
| 流式分析 | 谱系细胞检测混合物-生物素 | Miltenyi Biotec | 130-092-613 |
| 抗Ly6A-PE-cy7抗体 | BD Pharmingen | 558162 | |
| 抗CD117-APC抗体 | BD Pharmingen | 553356 | |
| 抗CD3e-FITC抗体 | eBioscience | 11-0031 | |
| 抗B220-APC抗体 | Invitrogen | RM2605 | |
| 抗CD11b-APC抗体 | BioLegend | 101212 | |
| 抗Ly-6G(Gr-1)-BV605抗体 | BioLegend | 108440 | |
| 抗CD45-PE抗体 | BD Pharmingen | 553081 | |
| 抗TER-119-APC抗体 | eBioscience | 17-5921 | |
| 抗CD41-BV605抗体 | BioLegend | 133921 | |
| 血管通透性实验 | 德克萨斯红葡聚糖 | Thermo Fisher Scientific | D1830 |
| 骨标记 | 钙黄绿素绿 | Sigma-Aldrich | C0875 |
| 茜素红 | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| BMSC培养 | RNA Plus微型试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708890 | |
| qPCR | TaqMan探针 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3'试剂盒（V3） | 10x Genomics | PN-10000075 |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 高通量试剂盒（150循环） | Illumina | TG-160-2002 | |
| 高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | 5067-4626 | |
| Qubit荧光计 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| 细胞分离 | 谱系细胞去除试剂盒 | MACS | 130-090-858 |
| CD45微珠 | MACS | 130-052-301 | |
| CD117微珠 | MACS | 130-091-224 | |
| 成像 | Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| FACSAriaIIu细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| PCR | C1000 Touch热循环仪 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、他莫昔芬给药方案（剂量、时间、给药途径）、基因型 阅读提示：Methods - Animal models |
| 组织处理和免疫染色 | 固定液（PFA浓度和时间）、脱钙方法（EDTA浓度和时间）、包埋介质、切片厚度、抗体稀释度 阅读提示：Methods - Sample processing and immunostaining |
| 血管通透性测定 | Dextran Texas Red的分子量、注射浓度和体积、循环时间 阅读提示：Methods - Vascular permeability assay |
| 组织学染色 | 染色类型（Safranin O、AZAN、网状纤维）的具体步骤和试剂 阅读提示：Methods - Histological staining methods |
| 骨标记 | Calcein Green和Alizarin Red的注射浓度、体积和时间 阅读提示：Methods - Calcein Green and Alizarin Red double labeling assay |
| µCT分析 | 扫描参数（voxel size、扫描范围） 阅读提示：Methods - µCT analysis |
| 流式细胞术 | 细胞制备方法、抗体组合和克隆号、染色条件、分析软件 阅读提示：Methods - Fluorescence-activated cell sorting |
| BMSC培养和qPCR | BMSC分离方法、培养条件、刺激物（TGFβ1, ET1, ADM）浓度和处理时间、qPCR探针 阅读提示：Methods - BMSC in vitro culture and quantitative PCR |
| 透射电镜 | 固定液成分、包埋方案、切片厚度 阅读提示：Methods - Electron microscopy |
| scRNA-seq | 组织消化方法、细胞分离流程、10x Chromium操作、测序平台和参数 阅读提示：Methods - Bone stromal cells preparation for scRNA-seq and scRNA-seq data analysis |