代谢组学筛查与临床样本分析
鉴定与癌症恶病质相关的循环代谢物变化，验证其在患者中的相关性。
对LLC荷瘤小鼠和肺癌腺癌患者的血清进行非靶向代谢组学分析，发现乳酸显著升高并与体重下降相关；分析患者手术前后乳酸水平。
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乳酸激活GPR81驱动肿瘤诱导的恶病质
Activation of GPR81 by lactate drives tumour-induced cachexia
实验完整度
高多层级验证：患者样本、多种小鼠模型、细胞实验、基因敲除和药物抑制，机制和功能验证结合。
主要模型
Lewis肺癌细胞(LLC)异种移植小鼠 KrasLSL-G12D/+;p53R172H/+自发肺癌小鼠 脂肪基质血管组分(SVF)来源的脂肪细胞 肺癌腺癌患者血清及脂肪组织样本
重点核对
皮下注射1×10^6 LLC细胞建立异种移植模型 通过尾静脉注射1×10^6 LLC细胞建立原位肺癌模型 使用渗透压泵以1,600 mg/ml或800 mg/ml剂量输注乳酸7或14天 GPR81敲除小鼠或脂肪特异性GPR81敲除小鼠 Gβγ抑制剂gallein、ROCK1抑制剂Y-27632、p38抑制剂SB203580的脂肪垫注射
摘要
恶病质影响50%至80%的癌症患者，占癌症相关死亡的20%，但其潜在机制仍不明确。在此，我们展示了循环乳酸水平与男性和女性癌症恶病质患者的体重下降程度以及临床相关小鼠模型的体重下降呈正相关。单独输注乳酸足以以剂量依赖性方式在无肿瘤小鼠中引发恶病质表型。此外，我们证明脂肪特异性G蛋白偶联受体（GPR）81敲除，类似于全身性GPR81缺陷，可改善雄性小鼠中乳酸诱导或肿瘤诱导的脂肪和肌肉消耗，揭示脂肪GPR81是乳酸分解代谢作用的主要介质。机制上，乳酸/GPR81诱导的恶病质独立于公认的蛋白激酶A分解代谢途径，而是由依次激活Gi–Gβγ–RhoA/ROCK1–p38的信号级联介导。这些发现强调了靶向GPR81治疗癌症这一危及生命的并发症的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 什么是连接肿瘤与恶病质中脂肪和肌肉消耗的因果因素？
- 核心机制
- 乳酸激活脂肪GPR81，通过Gαi/o-Gβγ-RhoA/ROC K1-p38级联反应促进脂肪褐变和脂解，进而导致肌肉萎缩和恶病质。
- 主要证据
- 通过患者和多种小鼠模型的代谢组学筛查发现乳酸升高；基因敲除和药理学抑制实验证实了GPR81和信号通路；UCP1敲除或脂肪GPR81敲除减轻恶病质。
- 研究意义
- 靶向GPR81及其下游信号通路为治疗癌症恶病质提供潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
乳酸输注诱导恶病质模型
验证乳酸单独是否足以诱导恶病质表型。
通过渗透压泵向无瘤小鼠输注L-乳酸（1.5或2 mmol/l）7或14天，监测体重、脂肪和肌肉质量变化。
GPR81在恶病质中的作用验证
确定GPR81是否介导乳酸和肿瘤诱导的恶病质。
使用GPR81敲除小鼠（全身或脂肪特异性）进行乳酸输注或肿瘤移植，评估体重、脂肪和肌肉质量、生存期、能量消耗等。
信号通路机制研究
阐明乳酸/GPR81下游信号通路。
在SVF来源的脂肪细胞中，通过基因敲低或药物抑制剂（PTX, gallein, Y-27632, SB203580）处理，检测p38、ATF2、UCP1的磷酸化或表达；在小鼠中注射抑制剂评估体重的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 乳酸测量 | Biosen C-Line葡萄糖乳酸分析仪 | EKF Diagnostics | 5213-0051-6200 |
| 乳酸输注 | 渗透压泵 | Alzet | 2001 |
| 乳酸标准品 | L-乳酸钠 | Sigma-Aldrich | 71718 |
| D-乳酸钠 | Sigma-Aldrich | 71716 | |
| 乳酸检测 | Lactate Scout分析仪 | EKF Diagnostics | Lactate Scout 4 |
| 乳酸试纸 | Kirgen | XC-rssz72 | |
| 抑制剂处理 | H89 | MedChemExpress | HY-15979A |
| SB203580 | MedChemExpress | 152121-47-6 | |
| Y-27632 | Solarbio | IY0050 | |
| Gallein | MedChemExpress | HY-D0254 | |
| PTX | List Biological Laboratories | 180 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Solarbio | 11965 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070063 | |
| 聚凝胺 | Solarbio | H8761 | |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Solarbio | P1261 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Bio-Rad | 1620177 |
| 磷酸化p38 MAPK抗体 | Cell Signaling | 4511T | |
| p38 MAPK抗体 | Cell Signaling | 8690T | |
| ATF2抗体 | Cell Signaling | 35031 | |
| 磷酸化PKA底物抗体 | Cell Signaling | 9624S | |
| β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling | 2146S | |
| 磷酸化ATF2抗体 | Abcam | ab32019 | |
| UCP1抗体 | Abcam | ab209483 | |
| GPR81抗体 | Novus | NBP1-51956 | |
| 免疫荧光 | UCP1抗体 | Cell Signaling | 72298S |
| 磷酸化p38 MAPK抗体 | Cell Signaling | 4511T | |
| p38 MAPK抗体 | Affinity | BF8015 | |
| 羊抗兔Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11012 | |
| 羊抗兔Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11011 | |
| 羊抗鼠Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
| 免疫组化 | UCP1抗体 | Sigma-Aldrich | U6382 |
| 辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | 31460 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Solarbio | S2110 |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜BX-53 | Olympus | -- |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜LSM880 | Zeiss | -- |
| RT-qPCR | TRIzol裂解液 | Invitrogen | 15596026 |
| cDNA合成试剂盒 | Transgen | AE311 | |
| LightCycler 96 | Roche | -- | |
| 代谢物提取 | 甲醇 | Merck | 1.06007.4008 |
| 代谢组学 | UPLC平台ACQUITY I-Class | Waters Corp | -- |
| Synapt G2-Si质谱仪 | Waters Corp | -- | |
| BEH Amide色谱柱 | Waters Corp | -- | |
| 磷酸化蛋白质组学 | Orbitrap Fusion Lumos LC-MS/MS系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 二氧化钛微珠 | GL Sciences | -- | |
| 代谢笼 | 代谢笼（CLAMS） | Columbus Instruments | -- |
| 体温测量 | 直肠温度探头BAT-12 | Physitemp | -- |
| 体成分分析 | 体成分分析仪500 | EchoMRI | -- |
| 握力测试 | 数字测力计DFX II | Chatillon | -- |
| 生化分析 | 自动生化分析仪cobas c311 | Roche | -- |
| 甘油测定 | 甘油检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | F005-1-1 |
| 细胞因子检测 | ProcartaPlex多细胞因子ELISA试剂盒 | eBioscience | PPX-06 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤模型建立 | 细胞系（如LLC, B16-F10等）及注射剂量、注射途径（皮下、尾静脉）、小鼠品系 阅读提示：Methods: Mice 部分 |
| 乳酸输注 | 渗透压泵植入时间、乳酸浓度、输注速率、持续时间 阅读提示：Methods: Delivery of lactate with osmotic minipumps |
| 基因敲除小鼠 | 敲除类型（全身或脂肪特异性）、小鼠品系背景、对照 阅读提示：Methods: Mice 部分 |
| 细胞实验 | SVF分离、分化条件、处理浓度（如20 mM乳酸）、预处理时间 阅读提示：Methods: Isolation of primary preadipocytes, Differentiation of SVF, 免疫印迹 |
| 抑制剂处理 | 抑制剂名称、剂量、给药途径、给药时间 阅读提示：Methods: Treatment with inhibitors |