构建和表征小鼠黑色素瘤模型
建立代表不同人类黑色素瘤分子亚型的同基因小鼠模型，并验证其与人类肿瘤的相似性。
通过基因工程和致癌物处理在C57BL/6小鼠中诱导四种黑色素瘤模型（M1-M4），并通过全外显子测序分析突变图谱、RNA-seq分析转录组、免疫组化分析分化标志物。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
多模型临床前平台预测黑色素瘤对免疫治疗的临床反应
Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy
实验完整度
高包含体外细胞系实验、体内同基因小鼠肿瘤模型及患者数据集验证等多个独立证据层级，并进行了功能验证（疫苗实验）和机制验证（免疫细胞分析、TIDE预测、MPS特征）。
主要模型
同基因小鼠黑色素瘤模型（M1-M4） C57BL/6小鼠 TCGA皮肤黑色素瘤数据集 黑色素瘤患者队列（Van Allen、Hugo-Riaz数据集）
重点核对
模型构建：M1-M4分别携带BrafCA/+;Ptenflox/+;Cdkn2aflox/+;Tyr-CreERT2-tg、BrafCA/+;Cdkn2aflox/+;Tyr-CreERT2-tg;Hgftg、Cdk4R24C/R24C;Hgftg、Hgftg等基因型，经UV或DMBA诱导 ICB治疗：抗CTLA-4抗体（BioXCell, BP0164, clone 9D9）10 mg/kg静脉注射，每周两次，共四次；抗PD-1抗体（BioXCell, BE0146, clone RMP1-14）200 μg/只腹腔注射，每3天一次，共三次 T细胞活化实验：M1、M2、M4细胞转导表达DCT 9aa肽-eGFP融合蛋白，与DCT反应性T细胞共培养24小时，ELISA检测IFN-γ 免疫表型分析：流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞（CD45+、CD3+、CD8+、CD4+、Treg等），N=5肿瘤/模型，重复两次 MPS评分：基于45基因（33个上调、12个下调）表达计算，验证于Van Allen和Hugo-Riaz数据集
摘要
尽管免疫治疗已经彻底改变了癌症治疗，但只有一部分患者能够获得持久的临床获益。明确的预测性生物标志物和克服耐药性的靶点仍未确定，这凸显了开发用于机制评估的可靠免疫活性模型的紧迫性。在此，我们表征了一组同基因小鼠模型，它们代表了人类黑色素瘤的各种分子和表型亚型，并展现了它们对免疫检查点阻断（ICB）的多样化反应。基因组、转录组和肿瘤浸润免疫细胞谱的比较分析证明了与临床观察的一致性，并验证了T细胞功能障碍和排除程序与耐药性的相关性。值得注意的是，全基因组表达分析发现了一个黑色素细胞可塑性特征，可预测患者对ICB的反应结果，表明黑色素瘤的多能性和分化状态可以决定ICB的获益。我们的比较临床前平台概括了黑色素瘤的临床行为，可用于识别改善患者护理的机制和治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立能够概括人类黑色素瘤分子和表型多样性及ICB反应差异的临床前模型，并利用其识别预测ICB疗效的生物标志物？
- 核心机制
- T细胞功能障碍（M1）和T细胞排除（M2）程序分别由肿瘤相关巨噬细胞和DC亚群维持；黑色素瘤细胞内在的黑素细胞多能性/分化状态（MPS）与ICB耐药相关。
- 主要证据
- 四个同基因小鼠模型（M1-M4）显示对抗CTLA-4和抗PD-1的不同反应（M1/M2耐药，M3部分敏感，M4敏感）；流式细胞术和RNA-seq显示M1中CD8+ T细胞耗竭（PD-1、LAG3、TIM3高表达），M2中T细胞排除（NK-cDC1轴降低，cDC2/Treg比例高）；MPS评分在多个患者队列中预测ICB反应和生存。
- 研究意义
- 该平台可用于机制研究和治疗策略开发，MPS与TIDE联合可改善患者结局预测；作者预期未来模型可扩展至其他黑色素瘤亚型，以加速发现更多生物标志物和免疫治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估对ICB的反应
测试四个模型对免疫检查点阻断（抗CTLA-4和抗PD-1）的治疗反应是否再现临床多样性。
将GDA或CLDA植入同基因小鼠，待肿瘤达到一定体积后随机分组，给予抗CTLA-4或抗PD-1抗体或同型对照处理，监测肿瘤生长和生存。
评估肿瘤免疫原性
确定不同模型对ICB的反应是否与肿瘤免疫原性相关。
使用γ-照射的肿瘤细胞进行疫苗接种实验，随后攻击相同的活细胞，比较肿瘤发生。
验证抗原呈递功能
检查四个模型MHC-I类抗原呈递途径是否完整。
IFN-γ刺激后检测MHC-I相关基因表达和H2-Kb表面表达；将DCT反应性T细胞与表达DCT肽的肿瘤细胞共培养，测量IFN-γ分泌和T细胞活化标志物。
分析肿瘤浸润免疫细胞
表征四个模型中肿瘤浸润免疫细胞的组成和功能，寻找与ICB反应相关的免疫相关性。
通过多参数流式细胞术和t-SNE分析未治疗肿瘤中的CD45+细胞和CD3+ T细胞亚群，包括CD8+、CD4+、Treg、γδ T细胞、巨噬细胞、DC、NK细胞等。
分析与ICB反应相关的免疫特征
探索耐药模型（M1、M2）的免疫抑制机制，并与临床数据验证。
通过流式细胞术和RNA-seq分析T细胞耗竭标志物、TIDE评分、巨噬细胞表型、NK-cDC1轴、cDC2/Treg比率等，并在患者数据集中验证。
开发并验证黑色素细胞可塑性特征（MPS）
利用耐药和敏感模型的转录组差异，构建能够预测ICB疗效的基因特征，并在临床数据集中验证。
比较M1/M2（耐药）与M3/M4（敏感）的转录组，通过逐步回归和Fisher精确检验筛选基因，构建45基因MPS，并在多个患者队列中验证其与反应和生存的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠模型构建 | 4-羟基他莫昔芬 | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-418 | |
| 体内治疗 | 抗CTLA-4抗体 | BioXCell | BP0164 |
| 小鼠IgG2b同型对照 | BioXcell | BP0086 | |
| 抗PD-1抗体 | BioXCell | BE0146 | |
| 大鼠IgG2a同型对照 | BioXcell | BE0089 | |
| 疫苗接种 | γ辐照仪 | JL Shepherd & Associates | -- |
| 免疫组织化学 | DCT抗体 | Pep8h | -- |
| TYRP1抗体 | Invitrogen | MA1-25303 | |
| SOX10抗体 | Cell Marque | 383R-15 | |
| CD3抗体 | BioRad | MCA1477 | |
| Impress AP试剂（抗兔Ig） | Vector | MP-5401 | |
| Impress AP试剂（抗大鼠IgG） | Vector | MP-5444 | |
| ImPACT Vector Red | Vector | SK-5105 | |
| 吉姆萨 | New Comer Supply | 1120A | |
| Western blot | 抗MET抗体 | Cell Signaling Technology | 3127 |
| 抗磷酸化MET抗体 | Cell Signaling Technology | 3077 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9188 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗GAPDH抗体 | EMD Millipore Corp | MAB374 | |
| 流式细胞术 | H2-Kb-APC抗体 | BioLegend | 116518 |
| 重组IFN-γ | MBL International | JM-4117-100 | |
| SuperScript III逆转录酶 | ThermoFiser Scientific | 18080044 | |
| qPCR试剂盒 | Kappa Biosystems | KK4603 | |
| CD8a磁珠 | BD Biosciences | 551516 | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7314 | |
| CD8a-APC抗体 | eBiosciences | 17-0081-82 | |
| CD137-PE抗体 | BioLegend | 106106 | |
| Vβ3-FITC抗体 | BD Pharmigen | 553208 | |
| CD90.1-PECy7抗体 | eBiosciences | 25-0900-82 | |
| 免疫表型分析 | DNase I | Roche | 10104159001 |
| IV型胶原酶 | Gibco | 17104-019 | |
| LIVE/DEAD固定死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 抗CD16/32抗体 | BioXcell | -- | |
| CD45.2抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗小鼠CD4抗体 | BD Biosciences | -- | |
| FOXP3/转录因子染色缓冲液试剂盒 | eBioscience | -- | |
| 光谱核型分析 | 秋水仙胺 | Invitrogen | 15210-040 |
| 小鼠SKY涂染试剂盒 | ASI | FPRPR0030 | |
| 全外显子组测序 | Covaris仪器 | Covaris | E210 |
| SureSelectXT文库构建试剂盒 | Agilent Technologies | G9611A | |
| Herculase II融合酶 | Agilent Technologies | 600679 | |
| Ampure XP磁珠 | Beckmann Coulter Genomics | A63882 | |
| SureSelectXT小鼠全外显子捕获 | Agilent Technologies | 5190-4641 | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素T1 | Life Technologies | 6560 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 模型构建 | 四种模型的基因型（Braf、Pten、Cdkn2a、Hgf、Cdk4等）和诱导方式（UV、DMBA、他莫昔芬）；M1、M2、M3需验证CreERT2激活（4-OHT剂量和给药方案）；UV照射剂量（红斑剂量） 阅读提示：Methods: Mouse models; Extended Data Fig. 1 |
| 细胞培养 | 各细胞系培养基（M1/M3/M4用RPMI+10%FBS+1%L-谷氨酰胺；M2用Tu2%培养基）；支原体检测和细胞系认证方法；CD8+ T细胞分离和培养条件（细胞因子、血清等） 阅读提示：Methods: Cell lines |
| 体内治疗 | 抗CTLA-4和抗PD-1的给药剂量、给药途径、时间安排（肿瘤体积、给药次数）；同型对照抗体；动物品系、性别、年龄（6-12周雌性C57BL/6） 阅读提示：Methods: In vivo treatments and vaccination assays; Fig. 2a; Extended Data Fig. 10a |
| 疫苗实验 | γ-照射剂量（M1/M3/M4为35 Gy，M2为200 Gy）；免疫细胞数量（1×10^6）；免疫和攻击时间间隔（4周）；对照组设置 阅读提示：Methods: In vivo treatments and vaccination assays; Extended Data Fig. 3a |
| 免疫细胞分析 | 肿瘤收集时间（100-300 mm3）；酶消化条件（DNase I、胶原酶IV、时间、温度）；抗体组合和荧光染料；固定/破膜缓冲液；流式细胞仪设置和补偿；数据分析软件（FlowJo、Cytofkit） 阅读提示：Methods: Phenotypic analysis of tumor immune infiltrate; Extended Data Fig. 5 |
| MPS评分计算 | 45个签名基因列表；FPKM数据来源；评分算法（加权和，权重+1/-1）；z分数转换；预测阈值（33rd百分位） 阅读提示：Methods: MPS development; Supplementary Table 8 |