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        阻断IL-6信号减轻Tet2缺陷克隆性造血中的动脉粥样硬化

        Blockade of IL-6 signaling alleviates atherosclerosis in Tet2-deficient clonal hematopoiesis

        作者信息Wenli Liu, Mustafa Yalcinkaya, Inés Fernández Maestre, Malgorzata Olszewska, Patrick B Ampomah, J Brett Heimlich, Ranran Wang, Pablo Sánchez Vela, Tong Xiao, Alexander G Bick, Ross Levine, Eirini P Papapetrou, Peter Libby, Ira Tabas, Nan Wang, Alan R Tall
        PMID37539077
        期刊Nat Cardiovasc Res
        发布时间2023-06
        DOI10.1038/s44161-023-00281-3
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含骨髓移植小鼠模型、体外BMDM实验、人类ESC/iPSC分化模型及患者样本scRNA-seq分析，涵盖功能验证和机制验证。

        主要模型

        Ldlr−/−小鼠骨髓移植Tet2缺陷骨髓细胞 Tet2缺陷BMDM TET2−/−人胚胎干细胞分化巨噬细胞 TET2+/−人iPSC分化巨噬细胞 TET2 CH患者PBMC

        重点核对

        骨髓移植模型中Tet2缺陷细胞比例（40% CD45.2 Tet2loxP/loxP; SCL-Cre-ERT细胞和60% CD45.1 WT细胞） IL-6R抗体给药剂量（10 mg/kg，腹腔注射，每周3次，持续10周） PLX3397给药剂量（200 mg/kg，混入西方饮食，喂养5周） BMDM处理条件（IL-6 25 ng/ml，血清饥饿诱导凋亡） 人类巨噬细胞分化方案（Spin EB方案，M-CSF和IL-3）

        摘要

        克隆性造血（CH）增加动脉粥样硬化性心血管疾病的风险，可能由于斑块炎症增加。人类研究表明，限制白细胞介素-6（IL-6）信号可能对具有大CH克隆的人群有益，特别是在TET2 CH中。在这里，我们显示IL-6受体抗体治疗逆转了由Tet2 CH促进的动脉粥样硬化，减少了单核细胞增多症、病变巨噬细胞负担和巨噬细胞集落刺激因子1受体（CSF1R）表达。IL-6通过增强STAT3与其启动子的结合，在Tet2缺陷巨噬细胞中诱导Csf1r表达。在小鼠和人类Tet2缺陷巨噬细胞中，IL-6增加CSF1R表达并增强巨噬细胞存活。使用CSF1R抑制剂PLX3397治疗逆转了Tet2 CH小鼠的加速动脉粥样硬化。我们的研究证明了IL-6信号在Tet2 CH加速动脉粥样硬化中的因果作用，确定了IL-6诱导的CSF1R表达是关键机制，并支持阻断IL-6信号作为CH驱动心血管疾病的潜在治疗。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        IL-6信号在Tet2缺陷克隆性造血（CH）加速动脉粥样硬化中是否起因果作用，其机制是什么？
        核心机制
        IL-6通过增强STAT3乙酰化及与Csf1r启动子结合，上调Tet2缺陷巨噬细胞CSF1R表达，激活PI3K-Akt信号通路，抑制凋亡，促进单核细胞增多和巨噬细胞积聚，从而加速动脉粥样硬化。
        主要证据
        IL-6R抗体逆转Tet2 CH小鼠的单核细胞增多及动脉粥样硬化；体外实验显示IL-6上调Tet2缺失BMDMs及人类TET2缺陷巨噬细胞CSF1R表达并抗凋亡；CSF1R抑制剂PLX3397完全逆转Tet2 CH小鼠的加速动脉粥样硬化；人类TET2 CH患者CD16+单核细胞CSF1R表达升高。
        研究意义
        研究揭示了IL-6信号在Tet2 CH加速动脉粥样硬化中的因果作用，确定IL-6诱导的CSF1R为关键机制，支持阻断IL-6信号作为CH驱动心血管疾病的潜在治疗策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        骨髓移植构建Tet2 CH小鼠模型

        模拟人类克隆性造血，评估Tet2缺陷对动脉粥样硬化的影响。

        将Tet2loxP/loxP; SCL-Cre-ERT或对照骨髓细胞移植到Ldlr−/−小鼠，部分实验中混合40% CD45.2 Tet2缺陷细胞和60% CD45.1 WT细胞，并给予西方饮食。

        2

        IL-6R抗体治疗实验

        评估IL-6R阻断对Tet2 CH小鼠单核细胞增多和动脉粥样硬化的影响。

        对Tet2 CH和对照小鼠腹腔注射IL-6R抗体或同型IgG，每周3次，共10周，同时喂食西方饮食，分析血液单核细胞、主动脉斑块等。

        3

        体外BMDM机制研究

        研究IL-6对Tet2缺陷巨噬细胞CSF1R表达的转录和表观遗传调控机制。

        从Tet2敲除或对照小鼠骨髓分化BMDM，用IL-6处理，检测CSF1R表达、STAT3结合、STAT3乙酰化、Csf1r启动子甲基化等。

        4

        CSF1R抑制剂PLX3397治疗实验

        验证CSF1R是IL-6信号促进动脉粥样硬化的下游关键效应分子。

        Tet2 CH和对照小鼠喂食含PLX3397的西方饮食5周，分析斑块面积、巨噬细胞含量等。

        5

        人类ESC/iPSC分化巨噬细胞验证

        验证TET2缺陷对人类巨噬细胞CSF1R表达和存活的影响。

        使用CRISPR-Cas9编辑的TET2−/−人ESC和TET2+/− iPSC分化HSPC和巨噬细胞，检测CSF1R表达、凋亡、PI3K/Akt信号等。

        6

        人类患者样本分析

        评估TET2 CH患者单核细胞中CSF1R表达是否升高。

        从TET2 CH患者和健康对照的PBMC中分离CD16+单核细胞，通过scRNA-seq分析CSF1R表达。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        骨髓移植流式细胞术
        验证细胞功能变化
        Annexin V凋亡检测蛋白质印迹
        验证分子表达变化
        定量PCR免疫荧光染色
        验证机制链路
        染色质免疫沉淀
        评估体内效果
        主动脉根部病变分析
        数据分析与统计
        单细胞RNA测序

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        动物实验培西达替尼MedChemExpressHY-16749
        西方饮食EnvigoTD.88137
        IL-6R抗体Bio X CellBE0047
        同型对照IgGBio X CellBE0090
        细胞培养重组人IL-6PeproTech200-06
        巨噬细胞集落刺激因子----
        白细胞介素-3----
        Western blot抗p-AKT抗体Cell Signaling Technology4060s
        抗Akt抗体Cell Signaling Technology4685
        抗p-PI3K抗体Cell Signaling Technology4228
        抗PI3K抗体Cell Signaling Technology4292s
        抗CSF1R抗体Cell Signaling Technology3152s
        抗裂解caspase-3抗体Cell Signaling Technology9661s
        抗乙酰化STAT3抗体Cell Signaling Technology2523
        抗lamin A/C抗体Cell Signaling Technology4777
        抗β-actin抗体Cell Signaling Technology4970s
        免疫荧光抗Mac2抗体Cedarlane LabsCL8942AP
        抗Ki67抗体Abcamab15580
        抗IL-6抗体R&D SystemsAF-406-NA
        抗RFP抗体Rockland600-401-379
        抗TREM2抗体Proteintech13483-1-AP
        抗IL-1β抗体Abcamab9722
        Masson三色染色试剂盒Sigma-AldrichHT15
        流式细胞术LSR II流式细胞仪BD Biosciences--
        抗CD45抗体BioLegend103116
        抗CD11b抗体BioLegend101216
        抗Gr-1抗体BioLegend108445
        抗CD115抗体BioLegend135510
        抗谱系混合抗体Thermo Fisher Scientific22-7770-72
        抗Sca-1抗体BioLegend108120
        抗c-Kit抗体BioLegend105826
        抗CD48抗体BioLegend103441
        抗CD150抗体BioLegend115929
        抗CD16/CD32抗体BioLegend101337
        抗CD34抗体BioLegend152216
        抗CD68抗体BioLegend333810
        抗CSF1R抗体BioLegend347303
        抗CD16抗体BioLegend302039
        抗CD14抗体BioLegend301813
        抗CD86抗体BioLegend305431
        抗HLA-DR抗体BioLegend307617
        ChIP-qPCR抗STAT3抗体Cell Signaling Technology9319
        其他PureLink基因组DNA提取试剂盒Thermo Fisher ScientificK182001
        Methylamp甲基化DNA捕获试剂盒EpigenTek--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        骨髓移植模型
        受体小鼠品系、供体骨髓基因型、他莫昔芬处理剂量和时间、移植细胞数、照射剂量及重建时间
        阅读提示：Methods: Bone marrow transplantation and antibody administration
        IL-6R抗体治疗
        IL-6R抗体及同型对照的来源、剂量、给药途径和频率
        阅读提示：Methods: Bone marrow transplantation and antibody administration; 图1b
        PLX3397治疗
        PLX3397的来源、混入饮食的剂量和持续时间
        阅读提示：Methods: Mice; 图4a
        BMDM培养与处理
        骨髓细胞分化条件、IL-6浓度和处理时间、血清饥饿持续时间、HDAC及DNMT抑制剂浓度
        阅读提示：Methods: BMDMs; 图3
        人类巨噬细胞分化
        ESC/iPSC分化方案、细胞因子浓度、分化时间、IL-6处理浓度和时间
        阅读提示：Methods: Human ESCs and iPSCs; 图5
        患者样本scRNA-seq
        患者纳入标准、样本处理、文库制备平台、测序深度、生物信息学分析参数
        阅读提示：Methods: Primary patient samples, scRNA-seq library preparation, 10X scRNA-seq and data preparation, scRNA-seq differential expression analysis

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