人类呼吸道上皮ALI培养与cryo-ET样品制备
获得可用于原位结构解析的完整人类运动性纤毛过渡区
原代人鼻上皮细胞经气液界面培养分化，机械解离后 plunge-frozen 于电镜载网，FIB减薄制备lamella，进行cryo-ET数据采集。
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人类纤毛过渡区的原位结构将连接蛋白缺陷与原发性纤毛运动障碍联系起来
In situ structure of the human ciliary transition zone links linker defects to primary ciliary dyskinesia.
实验完整度
高包含原位cryo-ET亚纳米结构解析、患者变异分析、TEM/SEM/U-ExM功能验证及CRISPR敲除验证
主要模型
原代人鼻上皮细胞气液界面培养 患者来源呼吸道上皮细胞 CRISPR-Cas9 ECT2L敲除的iPSC来源基底细胞分化模型
重点核对
原位cryo-ET子断层平均分辨率6.9–7.3 Å，TZ linker重构约8 Å 489例疑似PCD队列中鉴定出4例ECT2L或DZANK1双等位功能缺失变异个体 TEM定量TZ横截面异常比例及linker缺失比例 ALI培养纤毛运输实验显示颗粒平均速度显著降低 CRISPR-Cas9 ECT2L敲除重现球状纤毛尖端表型
摘要
纤毛过渡区（TZ）调节纤毛蛋白质组的组成，但其分子结构、蛋白质含量以及在运动性纤毛病中的作用仍不清楚。我们应用原位冷冻电子断层扫描和子断层平均技术研究了人类多纤毛上皮细胞。该方法以亚纳米分辨率解析了TZ特异性二联微管，并鉴定了九种组成蛋白。我们发现ECT2L和DZANK1形成相邻TZ二联微管之间的主要连接复合物。任一基因的双等位功能缺失变异均导致原发性纤毛运动障碍。ECT2L和DZANK1缺陷破坏了TZ结构，导致微管异常和球状纤毛尖端，并损害了黏膜纤毛清除功能。这些发现建立了TZ缺陷与人类运动性纤毛病之间的直接遗传联系，并说明原位结构生物学如何能够揭示人类疾病的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类运动性纤毛过渡区的分子结构组成是什么，TZ连接蛋白缺陷是否导致原发性纤毛运动障碍？
- 核心机制
- ECT2L和DZANK1形成TZ连接复合物维持TZ结构完整性；其功能缺失破坏TZ结构，导致微管异常和球状纤毛尖端，损害黏膜纤毛清除。
- 主要证据
- 原位cryo-ET解析TZ DMT及linker结构，鉴定ECT2L–SKP1和DZANK1–DYNLL1/2复合物；患者变异分析及CRISPR敲除验证TZ结构破坏和纤毛功能缺陷。
- 研究意义
- 建立了TZ缺陷与运动性纤毛病之间的直接遗传联系，扩展了TZ相关疾病的谱系，并展示原位结构生物学在揭示人类疾病机制中的应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TZ二联微管子断层平均与MIP鉴定
解析TZ DMT的蛋白组成和结构
对TZ DMT进行子断层平均、三维分类和局部精修，获得6.9–7.3 Å分辨率复合图，通过DomainSeeker和fold recognition鉴定CFAP20、CEP41、ENKD1、CAPSL和MAP9。
TZ linker结构解析与蛋白鉴定
解析相邻TZ DMT之间连接复合物的分子组成
对TZ linker密度进行聚焦精修和分类，获得约8 Å重构，通过AlphaFold2结构域文库筛选鉴定ECT2L和SKP1，并通过AlphaFold2-Multimer和共沉淀鉴定DZANK1。
患者变异鉴定与TZ结构功能验证
验证ECT2L和DZANK1功能缺失变异导致PCD及TZ结构破坏
在489例疑似PCD队列中筛选变异，对患者来源ALI培养细胞进行免疫荧光、TEM、SEM、高速视频显微镜和纤毛运输实验。
CRISPR-Cas9 ECT2L敲除功能验证
确认ECT2L缺失直接导致纤毛缺陷
在iPSC来源气道基底细胞中使用CRISPR-Cas9敲除ECT2L，分化为黏液纤毛上皮后进行RT-qPCR、免疫印迹、免疫荧光和电镜分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | PneumaCult-Ex Plus培养基 | STEMCELL Technologies | 05040 |
| PneumaCult-ALI培养基 | STEMCELL Technologies | 05001 | |
| PureCol胶原 | Sigma-Aldrich | 5006-15MG | |
| Transwell小室 | Corning | CLS3460 | |
| Primocin抗生素 | InvivoGen | ant-pm-05 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Accutase细胞解离液 | STEMCELL Technologies | 07920 | |
| cryo-ET样品制备 | QUANTIFOIL R3.5/1 300目金载网 | Electron Microscopy Sciences | Q350AR-35 |
| Vitrobot Mark IV冷冻制样仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FIB减薄 | Aquilos 2冷冻聚焦离子束/扫描电镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cryo-ET数据采集 | Titan Krios透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Falcon4i探测器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| U-ExM | Dispase II | Roche | 04942078001 |
| 抗α-微管蛋白抗体 | ABCD antibodies | AA345 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | ABCD antibodies | AA344 | |
| 抗CAPS2抗体 | Proteintech | 11924-1-AP | |
| 抗CAPSL抗体 | Proteintech | 17174-1-AP | |
| 抗DYNLL1抗体 | Proteintech | 18130-1-AP | |
| 抗DYNLL2抗体 | Proteintech | 16811-1-AP | |
| 抗DZANK1抗体 | Atlas Antibodies | HPA064255 | |
| 抗ENKD1抗体 | Atlas Antibodies | HPA041163 | |
| 抗ENKUR抗体 | Proteintech | 26440-1-AP | |
| 抗MAP9抗体 | Proteintech | 26078-1-AP | |
| 抗SKP1抗体 | Proteintech | 10990-2-AP | |
| 免疫荧光 | 抗乙酰化α-微管蛋白抗体 | Sigma Aldrich | T6793 |
| 抗α/β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2148 | |
| 抗ECT2L抗体 | Atlas antibodies | HPA035488 | |
| 抗DZANK1抗体 | Atlas antibodies | HPA064255 | |
| 抗CNTRL抗体 | Santa Cruz | sc-365521 | |
| 抗SKP1抗体 | Invitrogen | 32-3800 | |
| 抗IFT88抗体 | Proteintech | 13967-1-AP | |
| Hoechst 33342核染料 | Sigma | 14533-100MG | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠二抗 | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 546标记山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A11035 | |
| Alexa Fluor 568标记山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A11036 | |
| 基因敲除 | Cas9核酸酶 | IDT | 1081060 |
| 原代细胞P3电转液 | Lonza | V4XP-3032 | |
| RT-qPCR | RNeasy Mini RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| TaqMan逆转录试剂 | Applied Biosystems | N8080234 | |
| 蛋白表达与pull-down | Expi293F细胞 | Gibco | A14527 |
| 抗FLAG M2树脂 | Sigma | A2220 | |
| 3×FLAG多肽 | Sigma | -- | |
| 免疫印迹 | Bolt 4–12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | NW04120 |
| Immobilon-FL PVDF膜 | Millipore | IPFL00010 | |
| Intercept封闭液 | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| 抗Strep抗体 | Sigma-Aldrich | SAB2702216 | |
| 抗ECT2L抗体 | Novus Biologicals | NBP1-90847 | |
| 抗GAPDH抗体 | Fitzgerald Industries | 10R-G109a | |
| 抗乙酰化α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T7451 | |
| 纤毛运输实验 | FluoSpheres荧光2微米微球 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 高速视频显微镜 | Basler acA1300–200μm相机 | Basler | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ALI培养与分化 | 培养基类型（PneumaCult-Ex Plus和PneumaCult-ALI）、气液界面转换时间、纤毛发生观察时间（3–4周） 阅读提示：Methods 'Air-liquid interface (ALI) cultures'小节 |
| cryo-ET数据采集 | 显微镜电压（300 kV）、像素尺寸（2 Å）、倾斜范围（−48°至+48°）、步长（3°）、累计电子剂量（约150 e−/Å2） 阅读提示：Methods 'Cryo-ET data collection'小节 |
| TZ DMT子断层平均 | 颗粒拾取数量、分类策略、最终分辨率（6.9–7.3 Å）、使用的软件版本 阅读提示：Methods 'Subtomogram averaging'小节及figs. S1和S2 |
| 患者变异筛选 | 队列规模（489例）、变异过滤标准（MAF>1%排除）、ACMG指南、参考转录本 阅读提示：Methods 'Genetic testing'小节 |
| 纤毛运输实验 | 微球直径（2 μm）、ALI培养天数（>30天）、视频采集参数、统计方法（Mann-Whitney U检验） 阅读提示：Methods 'In vitro ciliary transport assays'小节及Fig. 6G图注 |