MiR-31 promotes mammary stem cell expansion and breast tumorigenesis by suppressing Wnt signaling antagonists.
使用miR-31过表达和敲除小鼠模型、MMTV-PyVT肿瘤模型、乳腺干细胞移植、体外细胞实验及TCGA数据，包含功能与机制验证。
K5-rtTA/TRE-miR31双转基因小鼠（乳腺基底上皮细胞诱导性过表达miR-31） miR-31全身敲除小鼠及K14-Cre;miR-31fl/fl条件敲除小鼠 MMTV-PyVT乳腺肿瘤模型及PyVT/miR-31KO小鼠 HC11小鼠乳腺上皮细胞和MCF7、BT549人乳腺癌细胞
DTG小鼠在1周龄起通过含Dox饮水诱导miR-31表达，12周龄分析乳腺表型 miR-31 KO小鼠在6周龄和10周龄分析乳腺发育和肺泡分化 PyVT和PyVT/KO小鼠在12、16、20周龄比较肿瘤面积、体积和转移 CD24+CD29high MaSC细胞的极限稀释移植实验（100、500、1000个细胞） 荧光素酶报告基因实验检测miR-31对Dkk1、Axin1、Gsk3β、Prlr 3'-UTR的靶向作用
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定miR-31在乳腺上皮各细胞群和肿瘤中的表达及其上游调控机制
分选Lin-CD24-CD29-、Lin-CD24-CD29+、Lin-CD24+CD29low和Lin-CD24+CD29high细胞群，qRT-PCR检测miR-31；原位杂交检测乳腺组织；在HC11细胞中敲低RANKL、使用荧光素酶报告和ChIP验证NF-κB结合miR-31启动子；检测PyVT肿瘤中miR-31及NF-κB通路标志物。
研究miR-31过表达在体内对乳腺上皮增殖和分化的作用
构建K5-rtTA/TRE-miR31双转基因小鼠，1周龄起通过含Dox饮水诱导miR-31在基底上皮过表达，12周龄分析全组织染色、H&E、Ki67免疫荧光、K14/K18和K14/SMA双免疫荧光。
研究miR-31缺失在体内对乳腺干细胞和肺泡分化的生理作用
构建miR-31全身敲除和K14-Cre;miR-31fl/fl条件敲除小鼠，分析6周和10周龄乳腺全组织染色、Ki67/Cyclin D1免疫染色、β-Casein、Gata-3、P-cadherin和p63表达；妊娠14.5天和哺乳期分析肺泡发育。
验证miR-31对MaSC自我更新和乳腺再生能力的直接作用
流式细胞术检测CD24+CD29high细胞群和Lgr5-GFP+细胞；体外克隆形成实验连续传代6次；极限稀释移植实验将CD24+CD29high细胞移植到NOD-SCID小鼠 cleared fat pad。
研究miR-31缺失对PyVT诱导的乳腺肿瘤生长、癌症干细胞和转移的影响
将miR-31 KO等位基因引入MMTV-PyVT小鼠，比较12、16、20周龄肿瘤面积和体积、Ki67增殖、Gata-3/ERα表达、K14/K8表达；流式检测CD24+CD90+癌症干细胞；极限稀释移植评估肿瘤起始能力；检测肺转移和EMT标志物。
确定miR-31对Wnt/β-catenin和TGFβ信号通路的影响及直接靶标
使用Axin2-LacZ报告小鼠检测Wnt活性；免疫组化和Western blot检测β-catenin、LBH、p-Smad2/3、p21；TOP/FOPflash和CAGA荧光素酶报告；预测并验证Axin1、Gsk3β、Dkk1、Smad3、Smad4的3'-UTR靶向；CLIP-PCR检测Ago2结合；Dkk1转基因挽救实验。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Sigma | R8758 |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 组织消化 | 胶原酶 | -- | -- |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 中性蛋白酶 | -- | -- | |
| DNase I | Sigma | -- | |
| 流式细胞术 | CD24-藻红蛋白-Cy7抗体 | BD | 560536 |
| CD29-异硫氰酸荧光素抗体 | BD | 561796 | |
| CD45-别藻蓝蛋白抗体 | BD | 559864 | |
| 小鼠CD31-别藻蓝蛋白抗体 | BD | 551262 | |
| 小鼠TER-119-别藻蓝蛋白抗体 | BD | 557909 | |
| CD90.2-藻红蛋白抗体 | BD | 553005 | |
| 可固定活力染料eFluor 450 | eBioscience | 65-0863-14 | |
| 克隆形成实验 | miR-31抑制剂 | Shanghai GenePharma Co., Ltd | -- |
| 对照RNA | Shanghai GenePharma Co., Ltd | -- | |
| 重组人表皮生长因子 | Stem Cell Technologies | -- | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | Stem Cell Technologies | -- | |
| 肝素 | Stem Cell Technologies | -- | |
| 青霉素 | Sigma | -- | |
| 链霉素 | Sigma | -- | |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 培养板插入式小室 | Millipore Cor. | -- | |
| 体外泌乳分化实验 | 地塞米松 | -- | -- |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 催乳素 | -- | -- | |
| Western blot | Dkk1抗体 | Abcam | ab61275 |
| Axin1抗体 | Santa Cruz | sc-14029 | |
| LBH抗体 | Santa Cruz | sc-161791 | |
| β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8480 | |
| β-actin抗体 | Santa Cruz | sc-1616 | |
| Gsk3β抗体 | Cell Signaling Technology | ab32391 | |
| p-Smad2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8828 | |
| Smad4抗体 | Santa Cruz | sc-7966 | |
| Rankl抗体 | Abcam | ab45039 | |
| p-p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| p-ikkα抗体 | Abcam | ab38515 | |
| p-AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9614 | |
| Gata3抗体 | Abcam | ab199428 | |
| Prlr抗体 | Santa Cruz | sc-20992 | |
| Cyclin D1抗体 | Abcam | ab134175 | |
| c-Myc抗体 | Abcam | ab32072 | |
| p-Stat5抗体 | Cell Signaling Technology | 9359 | |
| β-Tubulin抗体 | Abcam | ab6046 | |
| β-酪蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-166530 | |
| ERα抗体 | Santa Cruz | sc-542 | |
| K8抗体 | Abcam | ab59400 | |
| K14抗体 | Abcam | ab7800 | |
| ITGA2抗体 | Abcam | ab133557 | |
| ITGB1抗体 | Abcam | ab52971 | |
| p21抗体 | Abcam | ab109520 | |
| Smad3抗体 | Abcam | ab40854 | |
| P-cadherin抗体 | Santa Cruz | sc-7893 | |
| 免疫组织化学 | K14抗体 | Abcam | ab7800 |
| K18抗体 | Abcam | ab668 | |
| ERα抗体 | Santa Cruz | sc-542 | |
| PR抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Cyclin D1抗体 | Abcam | ab134175 | |
| c-Myc抗体 | Abcam | ab32072 | |
| Ki67抗体 | Thermo Fisher | sp6 | |
| β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8480 | |
| p-Stat5抗体 | Cell Signaling Technology | 9359 | |
| P-cadherin抗体 | Santa Cruz | sc-7893 | |
| p63抗体 | Abcam | ab124762 | |
| β-酪蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-166530 | |
| GFP抗体 | Abcam | ab290 | |
| Rankl抗体 | Abcam | ab45039 | |
| SMA抗体 | Sigma | A5228 | |
| K8抗体 | Abcam | ab59400 | |
| Gata3抗体 | Abcam | ab199428 | |
| Prlr抗体 | Santa Cruz | sc-20992 | |
| Slug抗体 | Abcam | ab27568 | |
| Vimentin抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| ITGA2抗体 | Abcam | ab133557 | |
| ITGB1抗体 | Abcam | ab52971 | |
| Dkk1抗体 | Abcam | ab61275 | |
| qRT-PCR | mirVana RNA分离试剂盒 | Ambion | -- |
| MMLV cDNA合成试剂盒 | Promega | -- | |
| SYBR-green检测系统 | Roche | -- | |
| TaqMan microRNA检测 | Applied Biosystems | -- | |
| 原位杂交 | TSA plus荧光素系统 | PerkinElmer | -- |
| 荧光素酶报告基因实验 | Dual-Glo荧光素酶报告基因检测 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒 | Promega | -- | |
| 细胞活力检测 | Cell Counting Kit 8 | Dojindo | -- |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | Sigma | -- |
| RNase A | Invitrogen | -- | |
| Triton X-100 | Sigma | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | SimpleCHIP酶法ChIP试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| Sonics Vibra-Cell超声仪 | Sonics | -- | |
| CLIP-qPCR | Protein A Dynabeads | Thermo Fisher | 100.02 |
| 山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| Ago2抗体 | -- | -- | |
| Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| miR-31过表达小鼠模型 | Dox诱导起始时间（1周龄）、Dox给药方式（饮水）、分析时间点（12周龄）及对照小鼠类型（WT、K5-rtTA、TRE-miR31） 阅读提示：Methods 'Mouse strains'；Results 'MiR-31 induction causes hyperplasia'；Fig. 2 legend |
| miR-31敲除小鼠模型 | 敲除策略（CRISPR/Cas9删除402 bp或条件性敲除第一外显子）、遗传背景（C57BL/6J）、分析时间点（6周和10周龄） 阅读提示：Methods 'Mouse strains'；Results 'MiR-31 prevents precocious alveolar differentiation'；Fig. 2 legend |
| 乳腺干细胞移植实验 | 移植细胞数（100、500、1000）、受体小鼠品系（NOD-SCID）和周龄（3周龄）、检测时间（移植后6-8周） 阅读提示：Methods 'Cell sorting and transplantation assay'；Fig. 4g legend |
| PyVT肿瘤模型 | PyVT小鼠遗传背景（FVB）、miR-31 KO等位基因引入方式、肿瘤分析时间点（12、16、20周龄）及样本量 阅读提示：Methods 'Mouse strains'；Results 'Loss of miR-31 results in compromised tumorigenesis'；Fig. 5 legend |
| 荧光素酶报告基因实验 | 使用的细胞系（HC11）、转染质粒量（4 μg或10 μg）、miR-31 mimics/inhibitor浓度及处理时间（24-36小时） 阅读提示：Methods 'Dual luciferase activity assays'和'TOP/FOP flash reporter assay' |
