CTA表达谱分析和测试平台建立
选择能最大程度代表CTA表达的肿瘤细胞系，用于后续功能筛选。
使用NanoString nCounter基因表达码集分析19种肿瘤细胞系的CTA表达，选出11种细胞系作为测试平台。
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癌症-睾丸抗原的综合功能表征定义了其在多种癌症标志中的必要参与
Comprehensive functional characterization of cancer-testis antigens defines obligate participation in multiple hallmarks of cancer.
实验完整度
高包含11种肿瘤细胞系体外模型、小鼠异种移植模型、患者组织样本、ChIP-Seq和表达谱分析，并进行功能与机制验证
主要模型
11种肿瘤来源细胞系（前列腺、乳腺、卵巢、皮肤、NSCLC和骨肿瘤） 三阴性乳腺癌细胞系WHIM12和SUM159 小鼠异种移植模型（WHIM12细胞皮下注射NSG小鼠） 人乳腺组织样本（10例TNBC、3例正常、5例癌旁良性）
重点核对
siRNA筛选使用11种细胞系，每种CTA独立敲低，96小时后检测APO、EdU和CTG FATE1敲低后120小时活力检测，使用≥4个独立实验 ZNF165敲低后WHIM12细胞TGFβ刺激（10 ng/ml）不同时间点的qPCR 小鼠异种移植：WHIM12细胞650,000个注射NSG小鼠，7周监测肿瘤生长 ChIP-Seq在WHIM12-ZNF165-V5细胞中进行，鉴定结合位点
摘要
肿瘤 frequently 激活那些表达 otherwise 偏向于睾丸的基因，统称为癌症-睾丸抗原（CTAs）。CTA 表达在多大程度上代表副现象或赋予致瘤特性尚不清楚。在本研究中，为了解决这个问题，我们实施了一种多维功能基因组学方法，该方法在 11 种不同的疾病设置中整合了 7 种不同的表型测定。我们鉴定了 26 个对肿瘤细胞活力必需和/或是 HIF、WNT 或 TGFβ 信号传导的病理性驱动因素的 CTAs。特别地，我们发现胎儿和成人睾丸表达 1（FATE1）是多种致癌背景中的关键生存因子。FATE1 防止应激感应 BH3-only 蛋白 BCL-2-相互作用杀手（BIK）的积累，从而允许在有毒刺激存在下的活力。此外，ZNF165 通过直接抑制负反馈调节通路的表达来促进 TGFβ 信号传导。这种作用对于三阴性乳腺癌细胞在体外和体内的生存至关重要。因此，CTAs 对肿瘤生物学做出显著的直接贡献。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌症-睾丸抗原（CTAs）在肿瘤中的异常表达是副现象还是赋予致瘤特性？
- 核心机制
- FATE1通过招募E3连接酶RNF183降解促凋亡蛋白BIK来促进肿瘤细胞生存；ZNF165通过直接抑制TGFβ负反馈调节因子SMURF2、SMAD7和PMEPA1的表达来增强TGFβ信号传导，并激活WISP1癌基因。
- 主要证据
- 在11种肿瘤细胞系中进行siRNA筛选，鉴定出26个对活力必需或调节HIF/WNT/TGFβ信号的CTAs；FATE1敲低导致BIK积累和caspase-3/7激活；ZNF165敲低抑制TNBC细胞体外活力和体内异种移植肿瘤生长。
- 研究意义
- CTAs对肿瘤生物学有直接贡献，具有致瘤功能的CTAs可能是抗癌疫苗或过继T细胞转移的最佳候选靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
siRNA筛选CTA对肿瘤细胞表型和信号通路的影响
鉴定对肿瘤细胞活力、凋亡、增殖以及HIF、Wnt、TGFβ、NF-κB信号通路有影响的CTAs。
在11种细胞系中分别敲低140个CTAs，进行APO、EdU、CTG测定和荧光素酶报告基因测定。
FATE1功能验证和机制研究
验证FATE1对肿瘤细胞生存的必要性，并探索其抗凋亡机制。
在多种细胞系中敲低FATE1，检测活力、caspase-3/7活性、 colony formation；通过免疫共沉淀和免疫印迹研究FATE1与RNF183、BIK的相互作用；使用BAX/BAK双敲除细胞和Bcl-xL过表达验证凋亡通路。
ZNF165功能验证和机制研究
验证ZNF165对TNBC细胞生存和TGFβ信号通路的影响，并鉴定其直接靶基因。
在TNBC细胞系中敲低或过表达ZNF165，检测活力、caspase-3切割、 colony formation；使用ChIP-Seq鉴定ZNF165结合位点；通过qPCR和免疫印迹验证靶基因表达。
体内验证ZNF165对肿瘤生长的影响
评估ZNF165敲低对TNBC异种移植肿瘤生长的影响。
将稳定表达shZNF165或对照的WHIM12细胞皮下注射到NSG小鼠，监测肿瘤生长7周，终点称重和Ki-67染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Technologies | -- |
| siRNA筛选 | siGENOME SMART pool siRNA文库 | Dharmacon/GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 活力检测 | CellTiter-Glo试剂 | Promega | -- |
| 凋亡检测 | Apo-ONE均质Caspase-3/7试剂 | Promega | -- |
| 增殖检测 | Click-iT EdU Alexa Fluor 488成像试剂盒 | Thermo Fisher Technologies | -- |
| 荧光素酶报告基因测定 | ONE-Glo荧光素酶测定系统 | Promega | -- |
| Dual Glo荧光素酶测定系统 | Promega | -- | |
| 免疫印迹 | GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-51907 |
| FATE1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101220 | |
| FATE1抗体 | Sigma | HPA034604 | |
| RNF183抗体 | Sigma | SAB2106627 | |
| Cleaved Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| PARP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9532 | |
| Bcl-xL抗体 | Cell Signaling Technology | 2764 | |
| 磷酸化SMAD2/3抗体 | Cell Signaling Technology | 8828 | |
| WISP1抗体 | Abcam | ab10737 | |
| SMURF2抗体 | Abcam | ab53316 | |
| ZNF165抗体 | Novus Biologicals | H00007718 | |
| SMAD2/3抗体 | Millipore | 07-408 | |
| V5抗体 | Life Technologies | R960 | |
| 免疫荧光 | c-Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 |
| TOM20抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-11415 | |
| GM130抗体 | Abcam | ab31561 | |
| 细胞色素c抗体 | BD Biosciences | 556432 | |
| HA抗体 | Covance | MMS-101R | |
| 过氧化氢酶抗体 | Calbiochem | 219010 | |
| 钙联蛋白抗体 | Enzo | ADI-SPA-860 | |
| COX IV抗体 | Cell Signaling Technology | 4850 | |
| β-微管蛋白抗体 | Sigma | T5293 | |
| 药物处理 | DMOG | Caymen Chemical | -- |
| Wnt-3a | R&D Systems | -- | |
| TGFβ | Cell Signaling | -- | |
| Q-VD-OPh | Sigma | -- | |
| qPCR | TRIzol | Thermo Fisher Scientific | -- |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChIP-Seq | ChIP级抗V5抗体 | Abcam | ab9116 |
| KAPA HTP文库制备试剂盒 | -- | -- | |
| Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G磁珠 | Life Technologies | -- |
| 自泛素化测定 | 重组E1 | Enzo Life Sciences | -- |
| 重组UbcH5b | Enzo Life Sciences | -- | |
| 牛红细胞泛素 | Sigma | -- | |
| 动物实验 | NOD.cg-PRKDCSCIDIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)小鼠 | -- | -- |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | C32H32Cl2N2O |
| Hoechst 3342三盐酸盐三水合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂含DAPI | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | Immobilon PVDF膜 | Millipore | -- |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Odyssey封闭液 | LI-COR Biosciences | -- | |
| IRDye抗体 | LI-COR Bioscience | -- | |
| 集落形成实验 | 吉姆萨染液 | Sigma | -- |
| qPCR | SYBR Green | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TaqMan实时PCR | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| siRNA筛选 | siRNA浓度250 nM；转染后96小时检测细胞生物学指标；HIF筛选转染后32小时用1 mM DMOG处理16小时 阅读提示：Methods 'siRNA screen and data processing'及Figure 1图注 |
| FATE1功能验证 | siFATE1转染后48-120小时检测活力；使用10 μM Q-VD-OPh抑制caspase；staurosporine 1 μM处理6小时 阅读提示：Methods 'Viability assays'、'Immunoblotting'及Figure 2、3图注 |
| ZNF165功能验证 | TGFβ刺激浓度10 ng/ml；siRNA转染后48-72小时检测；ChIP-Seq使用2 μg抗V5抗体 阅读提示：Methods 'ChIP and ChIP-Seq'、'Luciferase assays'及Figure 4、5图注 |
| 小鼠异种移植 | WHIM12细胞650,000个注射NSG小鼠；多西环素2 mg/ml饮水；肿瘤体积测量每周两次；7周监测 阅读提示：Methods 'Xenograft injections'及Figure 6图注 |
| 生存分析 | 患者分组 cutoff 值：结直肠癌 z-score>1.5，METABRIC 使用 mclust 确定；其他数据集 median cutoff 阅读提示：Methods 'Survival analysis'及Figure 3、4图注 |