建立同源敲入细胞模型并验证通路激活
确认PIK3CA突变细胞中PI3K通路激活及J124抑制效果。
使用MCF10A亲本细胞和Ex9-KI、Ex20-KI敲入细胞，Western blot检测p-AKT(T308)、总AKT、p-p42/44 MAPK和总p42/44 MAPK，比较J124处理与未处理。
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致癌性PIK3CA突变激活多种信号通路
Activation of diverse signalling pathways by oncogenic PIK3CA mutations.
实验完整度
高同源敲入细胞系、定量磷酸化蛋白质组学、蛋白质微阵列、体外激酶实验、突变回复和功能侵袭实验等多层证据
主要模型
MCF10A乳腺上皮细胞系及其PIK3CA E545K敲入（Ex9-KI）和H1047R敲入（Ex20-KI）同源细胞系 DLD1结直肠癌细胞系及其PIK3CA野生型和E545K突变同源细胞系 BT20乳腺癌细胞系
重点核对
MCF10A、Ex9-KI和Ex20-KI细胞经0.2 ng/ml EGF预处理3小时，再以500 ng/ml J124或0.05% DMSO处理30分钟 SILAC正向和反向标记生物学重复，磷酸肽强度变化阈值1.5倍 体外AKT1激酶实验使用100 ng AKT1、32P-ATP或1 mM ATP，30°C孵育30分钟 Matrigel侵袭实验每孔接种5×10^4细胞，24小时后计数10个随机视野 cortactin siRNA终浓度50 nM，转染后48小时检测敲低效率
摘要
PIK3CA基因在人类癌症中频繁突变。本研究利用含有PIK3CA‘驱动’致癌突变的同源敲入细胞系，进行基于SILAC的定量磷酸化蛋白质组学分析，以解析导致突变PIK3CA诱导的致癌表型的信号机制。从鉴定到的8,075个独特磷酸肽中，我们观察到PI3K通路的异常激活导致种类惊人的多种激酶及下游信号网络的磷酸化水平升高。在此，通过整合磷酸化蛋白质组数据与基于人类蛋白质微阵列的AKT1激酶实验，我们发现并验证了六个新的AKT1底物，包括cortactin。通过突变研究表明，AKT1对cortactin的磷酸化对于突变PI3K增强的细胞迁移和侵袭至关重要。我们的研究描述了一种定量且全局的方法，用于识别突变特异性信号事件，并发现作为通路激活读数或潜在治疗靶点的新信号分子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 致癌性PIK3CA突变如何全局影响信号网络并导致上皮细胞转化？
- 核心机制
- 突变PIK3CA激活PI3K-AKT通路，AKT1直接磷酸化cortactin的S405/T401和S417/S418位点，从而增强细胞迁移和侵袭。
- 主要证据
- SILAC定量磷酸化蛋白质组学鉴定8,075个磷酸肽，结合蛋白质微阵列和体外激酶实验验证六个新AKT1底物；cortactin磷酸化位点突变和siRNA敲低实验证明其对迁移侵袭的功能重要性。
- 研究意义
- 提供了突变PIK3CA诱导的信号扰动的全面定量图谱，并发现新的AKT1底物作为通路激活读数或潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SILAC定量磷酸化蛋白质组学分析
全局定量比较突变PIK3CA敲入细胞与亲本细胞的磷酸化差异，并评估J124对磷酸化的影响。
将MCF10A亲本细胞与J124或溶剂处理的Ex9-KI或Ex20-KI细胞进行3重SILAC标记，TiO2富集磷酸肽，LC-MS/MS分析，正向和反向标记重复。
磷酸化蛋白质组数据与蛋白质微阵列整合筛选AKT1底物
鉴定受PI3K调控且可被AKT1直接磷酸化的新底物。
将磷酸化蛋白质组中受PIK3CA调控的蛋白与蛋白质微阵列（4,191种全长人类蛋白）中AKT1体外磷酸化数据取交集，再用GST融合蛋白体外激酶实验验证六个候选底物。
验证cortactin为AKT1直接底物并定位磷酸化位点
确认AKT1直接磷酸化cortactin及其具体位点。
将纯化的cortactin与AKT1体外孵育，LC-MS/MS鉴定磷酸化位点；免疫荧光观察cortactin与pAKT共定位；在DLD1-wt/mt和BT20细胞中验证cortactin磷酸化受PI3K-AKT调控。
功能验证cortactin磷酸化对迁移侵袭的作用
确定cortactin及其AKT1磷酸化位点对PIK3CA突变细胞迁移和侵袭的影响。
siRNA敲低cortactin，或用野生型及四重磷酸化位点突变（S405A/T401A/S417A/S418A）的cortactin异构体A和B稳定过表达，进行Matrigel Boyden小室迁移侵袭实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
定量磷酸化蛋白质组分析
评估细胞功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12 (1:1)培养基 | -- | -- |
| 马血清 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 胰岛素 | Roche | -- | |
| 氢化可的松 | Sigma | -- | |
| 霍乱毒素 | Sigma | -- | |
| SILAC标记 | DMEM/F12 SILAC培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 轻标赖氨酸和精氨酸 | -- | -- | |
| 2H4-赖氨酸和13C6-精氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| 13C615N2-赖氨酸和13C615N4-精氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| PIK3CA抑制 | J124 | -- | -- |
| AKT抑制 | AKT抑制剂IV | -- | -- |
| 免疫印迹 | 抗p44/p42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 |
| 抗磷酸化p44/p42 MAPK-Thr202/Tyr204抗体 | Cell Signaling Technology | 9106 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化AKT-Ser473/Thr308抗体 | Cell Signaling Technology | 9271, 2965 | |
| 抗ACLY抗体 | Cell Signaling Technology | 4332 | |
| 抗磷酸化ACLY-Ser544抗体 | Cell Signaling Technology | 4331 | |
| 抗磷酸化GSK3β-Ser9抗体 | Cell Signaling Technology | 5538 | |
| 抗GSK3β抗体 | Cell Signaling Technology | 9832 | |
| 抗磷酸化EPHA2-Ser897抗体 | Cell Signaling Technology | 6347 | |
| 抗EPHA2抗体 | Epitomics | 3625 | |
| 抗β-ACTIN抗体 | Sigma | A5316 | |
| siRNA敲低 | cortactin siRNA | Qiagen | -- |
| RNAiMax转染试剂 | Invitrogene | -- | |
| 质粒构建 | pBABE-puro载体 | -- | -- |
| 定点突变 | QuikChange定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
| 病毒包装 | pCL-Ampho包装质粒 | Imagenex | -- |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 蛋白质消化 | TPCK处理胰蛋白酶 | -- | -- |
| 肽段脱盐 | C18反相柱 | Waters | -- |
| 强阳离子交换色谱 | PolySULPHOETHYL A柱 | PolyLC Inc. | -- |
| Agilent 1100高效液相色谱系统 | Agilent | -- | |
| 磷酸肽富集 | TiO2珠 | -- | -- |
| LC-MS/MS | LTQ-Orbitrap Velos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 数据分析 | Proteome Discoverer (v 1.3) | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Mascot (Version 2.2.0) | -- | -- | |
| SEQUEST | -- | -- | |
| PhosphoRS | -- | -- | |
| motif-x | -- | -- | |
| NetworKIN | -- | -- | |
| Cytoscape | -- | -- | |
| MCODE | -- | -- | |
| DAVID | -- | -- | |
| 体外激酶实验 | λ磷酸酶 | NEB | -- |
| 32P-ATP | -- | -- | |
| MemCode染色 | Thermo | -- | |
| 侵袭实验 | Biocoat Matrigel侵袭小室 | BD Biosciences | -- |
| DAPI | Invitrogen | -- | |
| 免疫荧光 | 抗cortactin单克隆抗体4F11 | Millipore | 05-180 |
| Alexa Fluor 568标记的山羊抗小鼠IgG二抗 | Invitrogen | A11031 | |
| 兔单克隆抗磷酸化AKT (pS473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4058 | |
| 兔多克隆抗WASP抗体 | Santa Cruz | SC-8350 | |
| 兔多克隆抗NCK1抗体 | Abcam | ab23120 | |
| 兔多克隆抗cofilin抗体 | Santa Cruz | SC-33779 | |
| Alexa fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗 | Invitrogen | A11034 | |
| 含DAPI的SlowFade Gold抗淬灭封片剂 | Life Technologies | S36938 | |
| LSM710共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| 免疫沉淀 | cortactin抗体4F11 | Millipore | 05-180 |
| 考马斯亮蓝R250 | -- | -- | |
| RT-PCR | TRIZOL试剂 | Invitrogen | -- |
| SuperScript II逆转录酶试剂盒 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SILAC标记与细胞处理 | SILAC标记氨基酸组合（light K/R、medium 2H4-K/13C6-R、heavy 13C6,15N2-K/13C6,15N4-R）、J124浓度500 ng/ml处理30分钟、EGF预处理0.2 ng/ml 3小时 阅读提示：Methods 'Cell culture and reagents' |
| 磷酸化蛋白质组学 | 磷酸肽富集使用TiO2 beads、SCX分级15个组分、质谱平台LTQ-Orbitrap Velos、磷酸化变化阈值1.5倍（升高）和0.67倍（降低） 阅读提示：Methods 'TiO2-based phosphopeptide enrichment'、'Liquid chromatography tandem mass spectrometry'、'Mass spectrometry data analysis' |
| 体外AKT1激酶实验 | AKT1用量100 ng、32P-ATP 250 µCi或1 mM ATP、30°C孵育30分钟、GST融合蛋白经λ磷酸酶预处理 阅读提示：Methods 'In vitro kinase assays' |
| Matrigel侵袭实验 | 每孔接种5×10^4细胞、MCF10A用1%马血清DMEM/F12而DLD1和BT20用无血清培养基、24小时后计数10个随机视野 阅读提示：Methods 'Matrigel invasion assays' |
| cortactin敲低与过表达 | siRNA终浓度50 nM、转染后48小时检测、过表达筛选使用0.5 µg/ml puromycin 阅读提示：Methods 'Immunoblotting and siRNA knockdown'、'Plasmids, site-directed mutagenesis and stable overexpression' |