CRISPR筛选鉴定RAS突变依赖性
鉴定与RAS热点突变（G12C、G12D、Q61R）相关的遗传依赖性。
在IL-3剥夺的Ba/F3等基因细胞系中进行全基因组慢病毒sgRNA文库筛选，并通过DepMap数据分析验证。
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靶向RAS突变癌症中的SHOC2-RAS相互作用
Targeting the SHOC2-RAS interaction in RAS-mutant cancers.
实验完整度
高包含CRISPR筛选、细胞系、动物模型、X射线晶体结构、SPR及小分子筛选等多层级验证
主要模型
Ba/F3等基因细胞系（表达KRAS或NRAS G12C/G12D/Q61R等突变） RAS突变癌细胞系（如MELJUSO、IPC298、UACC257等） NRAS(Q61*)黑色素瘤异种移植模型（MUGMEL2和IPC298）
重点核对
Ba/F3等基因细胞系中SHOC2敲除对NRAS/KRAS(Q61)突变体的选择性致死作用 NRAS(Q61R)与SHOC2直接相互作用的X射线共晶结构（PDB: 9BTM） 小分子化合物6在TR-FRET和SPR assay中的IC50/KD值 化合物6在NRAS(Q61mut)黑色素瘤细胞中抑制MAPK信号和3D增殖的剂量与时间 SHOC2 G290A突变体对化合物6的完全抗性验证
摘要
大鼠肉瘤（RAS）基因HRAS、NRAS和KRAS的激活突变共同代表人类癌症中最常见的致癌驱动因素。它们此前被认为不可成药，但过去几年的进展已促成靶向KRAS(G12C)和KRAS(G12D)突变体的药物的临床开发，有望在耐受剂量下产生治疗反应。然而，仍缺乏选择性靶向NRAS(Q61*)突变体（*代表‘任何’）的临床药物，该突变是黑色素瘤中第二常见的致癌驱动因素。在此，我们将SHOC2——SHOC2–MRAS–PP1C复合物的一个组分——鉴定为RAS(Q61*)肿瘤的依赖性，呈核苷酸状态依赖且不依赖异构体。在机制上，我们发现致癌性NRAS(Q61R)与SHOC2形成直接相互作用，并由X射线共晶结构所证实。体外高通量筛选发现了结合SHOC2并破坏其与NRAS(Q61*)相互作用的小分子。基于结构的优化产生了一种细胞活性工具化合物，在RAS突变癌症模型中显示出对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导和增殖的抑制，尤其是在NRAS(Q61*)背景下。这些发现为一种新形态的SHOC2–（经典）RAS蛋白相互作用提供了证据，该相互作用具有药理学可操作性并与癌症维持相关。总体而言，这项工作为在RAS信号通路核心开发新疗法提供了概念验证和基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SHOC2是否可以作为RAS(Q61*)突变癌症的靶点，以及能否开发出破坏SHOC2–RAS相互作用的小分子抑制剂？
- 核心机制
- 致癌性NRAS(Q61R)与SHOC2形成直接二元相互作用，该相互作用依赖于RAS的GTP结合状态；破坏该相互作用可抑制MAPK信号通路和肿瘤细胞增殖。
- 主要证据
- 通过Ba/F3等基因细胞系的CRISPR筛选和DepMap数据分析发现SHOC2是RAS(Q61*)的选择性依赖；X射线共晶结构（2.53 Å）证实NRAS(Q61R)与SHOC2的直接结合；高通量筛选和结构优化获得化合物6，在TR-FRET、SPR、NanoBiT和细胞实验中验证其破坏SHOC2–NRAS(Q61*)相互作用并抑制MAPK信号和增殖。
- 研究意义
- 提供了靶向SHOC2–RAS相互作用的药理学概念验证，为开发针对RAS(Q61*)突变癌症（如黑色素瘤）的新型疗法奠定了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SHOC2遗传验证
验证SHOC2在RAS(Q61*)突变癌症模型中的依赖性。
使用多西环素诱导的shRNA敲低SHOC2，在多种RAS突变癌细胞系中检测对增殖、MAPK信号和体内肿瘤生长的影响。
SHOC2–NRAS(Q61R)二元相互作用的结构和生物物理验证
验证SHOC2与致癌性NRAS(Q61R)的直接相互作用并解析其结构基础。
通过分析超速离心和SPR检测二元复合物形成，并解析X射线共晶结构。
高通量筛选发现SHOC2结合物
发现能结合SHOC2并破坏其与NRAS(Q61R)相互作用的小分子或肽。
建立TR-FRET竞争性结合 assay，筛选约320,000个小分子和mRNA展示肽库。
先导化合物优化与结构验证
优化先导化合物活性并获得共晶结构指导合理设计。
合成化合物1-7，测定TR-FRET IC50和SPR KD，解析肽4和化合物(R)-5与SHOC2的共晶结构。
化合物6的细胞活性和特异性验证
验证化合物6在细胞中破坏SHOC2–NRAS(Q61*)相互作用、抑制MAPK信号和增殖的特异性。
使用NanoBiT assay、免疫印迹、3D增殖 assay和RNA-seq检测化合物6的细胞效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1940 GlutaMAX培养基 | ThermoFisher | 61870-036 |
| 胎牛血清 | Corning | 35-015-CV | |
| 重组鼠IL-3 | Life Technologies | PMC0035 | |
| HEPES | BioConcept | 5-31F00-H | |
| Western blot | PhosSTOP磷酸酶抑制剂片剂 | Sigma | 4906845001 |
| cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂片剂 | Sigma | 4693159001 | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| Laemmli缓冲液 | Bio-Rad | 1610747 | |
| Criterion TGX 4–15%预制胶 | Bio-Rad | 5671085 | |
| Trans-Blot Turbo Midi硝酸纤维素转印膜 | Bio-Rad | 1704159 | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | 1704150 | |
| FUSION FX7成像系统 | VILBER | -- | |
| SHOC2抗体 | Cell Signaling Technology | 53600 | |
| 磷酸化c-Raf Ser259抗体 | Cell Signaling Technology | 9421 | |
| 磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2)抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 磷酸化MEK1/2 Ser217/221抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| vinculin抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| α-tubulin抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 | |
| 活性RAS pull-down | RAS激活检测生化试剂盒 | Cytoskeleton | BK008 |
| Ba/F3细胞系构建 | NEON电转仪 | Invitrogen | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测 | Promega | G7572 |
| 集落形成实验 | 盐酸多西环素 | Fisher Bioreagent | BP26535 |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 3D增殖实验 | Incucyte SX5活细胞分析系统 | Satorius, Essen Bioscience | -- |
| 超低吸附微孔板（384孔透明圆底板） | Corning | 3830 | |
| qPCR | RNeasy试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| Quantitec PCR预混液 | Qiagen | 204643 | |
| TaqMan检测SHOC2 | Invitrogen | Hs00201309_m1 | |
| TaqMan检测NRAS | Invitrogen | Hs00180035_m1 | |
| RNA-seq | NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 蛋白结晶 | Hampton research晶种珠 | Hampton research | HR2-320 |
| SPR | Biacore 8k仪器 | GE Healthcare | -- |
| 链霉亲和素包被传感器芯片 | Cytiva | BR-1005-31 | |
| TR-FRET | 铕标记抗His抗体 | PerkinElmer | -- |
| Cy5-链霉亲和素偶联物 | GE Healthcare/Amersham | PA45001 | |
| PHERAStar FSX微孔板阅读器 | BMG Labtech | -- | |
| DSF | Sypro Orange | Invitrogen | -- |
| Opus qPCR热循环仪 | BioRad | -- | |
| NanoBiT | NanoGlo Live底物 | Promega | N2012 |
| 抗LgBiT抗体 | Promega | N7100 | |
| 无酚红Opti-MEM | Gibco | 11058 | |
| 96孔平底微孔板 | Thermo Fisher | 136102 | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD | -- |
| 多西环素 | Sigma Aldrich | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni-Sepharose HP | Cytiva | -- |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg尺寸排阻柱 | Cytiva | -- | |
| PD-10柱 | Cytiva | -- | |
| GMPPNP | Jena Bioscience | -- | |
| GDP | Sigma | -- | |
| 虾碱性磷酸酶 | New England Biolabs | -- | |
| HisTrap HP 5 ml柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex 200 pg尺寸排阻柱 | Cytiva | -- | |
| NMR | L-甲硫氨酸（甲基-13C） | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-206-1 |
| ESF921 Delta系列缺甲硫氨酸培养基 | Expression Systems | 96-200 | |
| ESF921 | Expression Systems | 96-001-01 | |
| 化学合成 | tert-butyl (S)-(5-bromo-2,3-dihydrobenzofuran-3-yl)carbamate | -- | -- |
| 4,4,4′,4′,5,5,5′,5′-octamethyl-2,2′-bi(1,3,2-dioxaborolane) | -- | 73183-34-3 | |
| 5-aminobenzo[d]oxazol-2(3H)-one | -- | 14733-77-8 | |
| methyl 2-(2-hydroxyphenyl)acetate | -- | 22446-37-3 | |
| (5-bromo-2-chlorophenyl)methanol | -- | 149965-40-2 | |
| DIAD | -- | 2446-83-5 | |
| 苯硼酸 | -- | 98-80-6 | |
| 4-(benzyloxy)-3-nitrobenzaldehyde | -- | 22955-07-3 | |
| (S)-2-methylpropane-2-sulfinamide | -- | 343338-28-3 | |
| 2-(3-iodophenyl)acetic acid | -- | 1878-69-9 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Ba/F3等基因细胞系构建与筛选 | 细胞系来源、突变类型、IL-3剥夺条件、sgRNA文库、感染复数、筛选时间 阅读提示：Methods中'Ba/F3 cell-line generation'和'CRISPR KO experiments'小节，以及Fig. 1c图注 |
| SHOC2敲低实验 | shRNA序列、多西环素浓度、处理时间、细胞系、检测指标 阅读提示：Methods中'Lentiviral shRNA constructs'和'Colony formation assay'小节，以及Fig. 2c–e图注 |
| 化合物6细胞处理 | 化合物浓度、处理时间、细胞系、DMSO浓度、检测方法 阅读提示：Methods中'Compound dilution'和'NanoBiT assay'小节，以及Fig. 4e–i图注 |
| 异种移植瘤实验 | 细胞接种数量、小鼠品系、多西环素给药方案、肿瘤体积测量频率、样本量 阅读提示：Methods中'Mouse studies'小节，以及Fig. 2f和Extended Data Fig. 2d图注 |
| TR-FRET竞争性结合实验 | 蛋白浓度、化合物稀释系列、缓冲液组成、孵育时间、检测仪器 阅读提示：Methods中'TR-FRET assay SHOC2–NRAS Q61R'小节 |