鉴定胆固醇营养缺陷型癌细胞系
筛选对细胞外胆固醇依赖的癌症细胞系
用DNA条形码标记28种癌症细胞系，混合培养在脂蛋白充足或缺乏的培养基中，通过测序检测条形码丰度变化。
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胆固醇营养缺陷型淋巴瘤中角鲨烯的积累阻止了氧化性细胞死亡
Squalene accumulation in cholesterol auxotrophic lymphomas prevents oxidative cell death.
实验完整度
高包含体外细胞系、原发肿瘤样本、CRISPR筛选、小鼠异种移植和患者来源异种移植模型，并进行功能与机制验证
主要模型
ALK+ ALCL细胞系（如DEL、Karpas 299） ALK+ ALCL患者来源异种移植（PDX）模型 小鼠皮下肿瘤异种移植模型 28种癌症细胞系DNA条形码混合竞争文库
重点核对
LPDS培养基（10%脂蛋白缺乏血清）培养3周，比较FBS、LPDS、LPDS/LDL（25 μg/ml）条件下条形码丰度 SQLE表达缺失通过Western blot和RT-qPCR在细胞系和原发肿瘤中验证 角鲨烯水平通过质谱和受激拉曼散射显微镜检测 CRISPR-Cas9敲除LDLR或FDFT1后，在体内外检测ALCL细胞增殖和肿瘤生长 铁死亡诱导剂ML162（20 nM）和Fer-1（1 μM）处理5天，检测细胞活力和脂质过氧化
摘要
胆固醇是细胞生长和增殖所必需的。正常哺乳动物细胞通过摄取或从头合成来满足对胆固醇的需求，但癌细胞对这两种途径的依赖程度仍知之甚少。本文中，我们对DNA条形码标记的细胞系混合文库进行竞争性增殖实验，鉴定出一个对胆固醇营养缺陷、因而高度依赖胆固醇摄取的细胞系亚群。代谢基因表达分析指出，角鲨烯单加氧酶（SQLE）表达的缺失是胆固醇营养缺陷的原因，尤其是在ALK+间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）细胞系和原发肿瘤中。SQLE催化胆固醇合成途径中角鲨烯氧化为2,3-氧化角鲨烯，其缺失导致上游代谢物角鲨烯的积累，而角鲨烯通常检测不到。在ALK+ ALCL中，角鲨烯改变了细胞脂质谱并保护癌细胞免于铁死亡性细胞死亡，在氧化应激条件和肿瘤异种移植中提供了生长优势。最后，基于CRISPR的遗传筛选鉴定出通过低密度脂蛋白受体（LDLR）摄取胆固醇对ALCL细胞在培养中的生长以及作为患者来源异种移植物的生长至关重要。这项工作揭示了ALCL的胆固醇营养缺陷是一个可靶向的弱点，并且更广泛地说，系统性的方法有助于识别个别癌症类型特有的营养依赖性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌细胞对胆固醇摄取的依赖性及其代谢基础是什么？
- 核心机制
- ALK+ ALCL细胞因SQLE表达缺失而胆固醇营养缺陷，导致角鲨烯积累；角鲨烯改变膜脂质组成并保护细胞免于铁死亡，从而在氧化应激下提供生长优势。
- 主要证据
- DNA条形码竞争实验鉴定胆固醇依赖细胞系；SQLE缺失导致角鲨烯积累；FDFT1敲除或SQLE过表达消除角鲨烯积累并增加铁死亡敏感性；CRISPR筛选和PDX模型验证LDLR对肿瘤生长至关重要。
- 研究意义
- 揭示ALK+ ALCL的胆固醇营养缺陷是可靶向的代谢弱点，LDLR可能成为治疗靶点；提供了一种识别癌症营养依赖性的通用方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定SQLE缺失是胆固醇营养缺陷的原因
验证SQLE表达缺失导致胆固醇依赖和角鲨烯积累
在SNU-1细胞中过表达SQLE，检测在LPDS条件下的增殖；用质谱检测角鲨烯水平；在ALCL细胞系中检测SQLE表达和角鲨烯积累。
验证LDLR对ALCL细胞生长的重要性
确定LDLR介导的胆固醇摄取对ALCL细胞存活和肿瘤生长的必要性
使用CRISPR-Cas9敲除LDLR，检测细胞增殖和肿瘤生长；使用抗LDLR单克隆抗体处理细胞；在PDX模型中进行sgRNA竞争实验。
研究角鲨烯积累对铁死亡敏感性的影响
验证角鲨烯积累保护ALCL细胞免于铁死亡
敲除FDFT1阻断角鲨烯合成，或用SQLE抑制剂处理，检测细胞对GPX4抑制剂（ML162、RSL3）诱导的铁死亡的敏感性；检测脂质过氧化和膜PUFA组成。
评估角鲨烯合成对体内肿瘤生长的影响
验证角鲨烯合成对ALCL肿瘤生长的促进作用
将FDFT1敲除的Karpas 299细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠，检测肿瘤重量；在PDX模型中进行sgFDFT1竞争实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应或细胞死亡
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | SQLE抗体 | ProteinTech | 12544-1-AP |
| 免疫组织化学 | SQLE抗体 | Atlas Antibodies | HPA020762 |
| 免疫印迹 | β-肌动蛋白抗体 | GeneTex | GTX109639 |
| ACSL4抗体 | GeneTex | GTX100260 | |
| GAPDH抗体 | GeneTex | GTX627408 | |
| LDL受体抗体 | Abcam | ab52818 | |
| NPC1抗体 | Abcam | ab36983 | |
| GPX4抗体 | Abcam | ab41787 | |
| FDFT1抗体 | Protein Tech | 13128-1-AP | |
| ALK抗体 | CST | C26G7 | |
| STAT3抗体 | CST | 9132 | |
| 磷酸化STAT3抗体 | CST | 9131 | |
| 组蛋白H3抗体 | CST | 4499 | |
| HRP标记抗兔抗体 | Santa Cruz | -- | |
| 小鼠IgG1同型对照抗体 | BioCell | -- | |
| 细胞培养 | 基质胶 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | -- | |
| 角鲨烯 | Sigma | -- | |
| 胆固醇 | Sigma | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | Invivogen | -- | |
| 低密度脂蛋白 | Lee BioSolutions | -- | |
| 油酸 | Santa Cruz | -- | |
| 流式细胞术 | Dil标记低密度脂蛋白 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | NB-598马来酸盐 | Adooq Bioscience | -- |
| ML162 | Aobious | -- | |
| erastin | Tocris | -- | |
| RSL3 | Selleckchem | -- | |
| zaragozic acid A | Cayman Chemical | -- | |
| Ferrostatin-1 | Abcam | -- | |
| 克唑替尼 | Sigma | -- | |
| 阿托伐他汀 | Sigma | -- | |
| 5-氮杂胞苷 | Sigma | -- | |
| 5-氮杂-2′-脱氧胞苷（地西他滨） | Sigma | -- | |
| Shield-1 | CheminPharma | -- | |
| 细胞培养 | REVOLVE4显微镜 | Echo Laboratories | -- |
| RPMI培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛脂蛋白缺乏血清 | Kalen Biomedical | -- | |
| 同位素示踪 | [U-13C]-乙酸钠 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-156 |
| 克隆 | T4连接酶 | NEB | -- |
| 细胞活力检测 | Cell Titer Glo试剂 | Promega | -- |
| SpectraMax M3酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| Superscript II逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| SYBR green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| ABI实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Dil-LDL摄取 | HBSS缓冲液 | Gibco | -- |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| 转染 | XtremeGene转染试剂 | Roche | -- |
| 免疫印迹 | Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 亚硫酸氢盐测序 | EZ DNA甲基化-闪电试剂盒 | Zymo | #D5030 |
| ZR-96 DNA清洁浓缩器 | Zymo | #D4023 | |
| MiSeq V2 300bp试剂盒 | Illumina | -- | |
| CRISPR筛选 | NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| 脂质过氧化检测 | BD LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 拉曼光谱 | 共聚焦拉曼显微光谱仪 | HORIBA Jobin Yvon | -- |
| 受激拉曼散射显微镜 | FV1200显微镜 | Olympus | -- |
| picoEmerald激光器 | Applied Physics and Electronics | -- | |
| 硅光电二极管 | Thorlabs | FDS1010 | |
| 锁相放大器 | Stanford Research Systems | SR844 | |
| 带通滤光片 | Chroma Technology | 890/220 CARS | |
| 电光调制器 | -- | -- | |
| 油浸聚光镜 | Olympus | -- | |
| 水浸25倍物镜 | Olympus | XLPLNXWMP2 | |
| 细胞培养 | 胶原酶A | -- | -- |
| 中性蛋白酶II | -- | -- | |
| DNA酶 | -- | -- | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | -- | |
| 抗体纯化 | 蛋白G树脂 | GenScript | -- |
| 蛋白G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare | -- | |
| 液相色谱-质谱 | Ascentis Express C18色谱柱 | Sigma-Aldrich | -- |
| Dionex UltiMate 3000超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QExactive台式轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 数据分析 | LipidSearch软件 | ThermoFisher Scientific/ Mitsui Knowledge Industries | -- |
| XCalibur QuanBrowser 2.2 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FlowJo v.10软件 | -- | -- | |
| GraphPad PRISM 7 | -- | -- | |
| Microsoft Excel 15.21.1 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DNA条形码竞争实验 | 细胞系种类（28种）、条形码数量（每个细胞系3个独立条形码）、培养基条件（FBS、LPDS、LPDS/LDL 25 μg/ml）、培养时间（2周） 阅读提示：Methods 'DNA-barcode cell mixing' 和 Figure 1c |
| 细胞增殖实验 | 细胞接种密度（5000细胞/孔）、培养基（RPMI-1640 + 10% FBS或LPDS）、LDL浓度（100 μg/ml）、游离胆固醇浓度（10 μg/ml）、检测时间（5天或6天）、检测试剂（Cell Titer Glo） 阅读提示：Methods 'Proliferation Assays' |
| CRISPR-Cas9敲除 | sgRNA序列、载体（lentiCRISPR-v2或DD-Cas9）、Shield-1浓度（250 nM）和处理时间（3天）、嘌呤霉素筛选浓度 阅读提示：Methods 'Generation of Knockout and cDNA Overexpression Cell Lines' 和 Supplementary Table 3 |
| 铁死亡诱导实验 | ML162浓度（20 nM或200 nM）、RSL3浓度（30 nM）、Fer-1浓度（1 μM）、处理时间（5天或24小时）、细胞系（Karpas 299等） 阅读提示：Figure 4d 和 Extended Data Fig. 6d,e |
| 患者来源异种移植（PDX）模型 | 小鼠品系（NSG）、细胞接种数量（1×10^6细胞/100 μL 30% Matrigel）、肿瘤生长时间（2-4周）、sgRNA竞争实验的sgRNA数量（5个对照sgRNA、4个LDLR sgRNA、5个FDFT1 sgRNA） 阅读提示：Methods 'Mouse studies' 和 'Mini competition assay' |