巨噬细胞极化模型建立及lncRNA谱分析
建立M0、M1样和M2样巨噬细胞模型，筛选M2样巨噬细胞中差异表达的lncRNAs。
THP-1细胞经PMA诱导为M0，再用LPS/IFN-γ或IL-4诱导为M1样或M2样巨噬细胞；提取RNA进行lncRNA微阵列分析。
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NR_109/FUBP1/c-Myc轴调节TAM极化并重塑肿瘤微环境以促进癌症发展
The NR_109/FUBP1/c-Myc axis regulates TAM polarization and remodels the tumor microenvironment to promote cancer development
实验完整度
高包含体外细胞实验（THP-1、PBMC来源巨噬细胞极化模型）、体内动物实验（HSC-NPG小鼠人源化模型、裸鼠转移模型）、患者样本分析（GC、BC组织及TAMs）以及机制研究（RNA pull-down、RIP、ChIP等），涉及功能验证和机制验证。
主要模型
THP-1诱导的M0/M1/M2样巨噬细胞 PBMC来源的巨噬细胞 HSC-NPG人源化小鼠皮下移植瘤模型 BALB/c裸鼠尾静脉转移模型
重点核对
THP-1细胞诱导M2样巨噬细胞时IL-4浓度为20 ng/mL HSC-NPG小鼠皮下移植瘤模型中BGC-823细胞与巨噬细胞比例为3:1 裸鼠转移模型中BGC-823细胞与巨噬细胞比例为3:1 FUBP1抑制剂FUBP1-IN-1处理M2样巨噬细胞的浓度为24 μM，时间为24小时 细胞培养条件：37℃、5% CO2
摘要
编者按：关于使用BGC-823细胞系的说明。
背景
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境（TME）的主要成分，在肿瘤进展中发挥重要作用。由于TAMs的异质性和可塑性，调节TAMs的极化状态被认为是肿瘤的潜在治疗策略。长链非编码RNA（lncRNAs）已涉及多种生理和病理过程，但lncRNAs如何操纵TAMs极化状态的潜在机制仍不清楚，有待进一步研究。
方法
采用微阵列分析来表征THP-1诱导的M0、M1和M2样巨噬细胞中涉及的lncRNA谱。在这些差异表达的lncRNAs中，进一步研究了NR_109在M2样巨噬细胞极化中的功能，以及NR_109介导的巨噬细胞条件培养基或巨噬细胞对肿瘤增殖、转移和TME重塑的影响，包括体外和体内实验。此外，我们揭示了NR_109如何与远上游元件结合蛋白1（FUBP1）相互作用，通过竞争性结合JVT-1阻碍泛素化修饰来调节蛋白质稳定性。最后，我们检测了肿瘤患者的切片，探讨NR_109及相关蛋白表达之间的相关性，显示NR_109的临床意义。
结果
我们发现lncRNA NR_109在M2样巨噬细胞中高表达。敲低NR_109阻碍了IL-4诱导的M2样巨噬细胞极化，并显著降低了M2样巨噬细胞在体外和体内支持肿瘤细胞增殖和转移的活性。机制上，NR_109与JVT-1竞争结合FUBP1的C端结构域，阻碍FUBP1的泛素介导降解，激活c-Myc转录，从而促进M2样巨噬细胞极化。同时，作为转录因子，c-Myc可结合NR_109启动子并增强NR_109的转录。临床上，在肿瘤组织的CD163+ TAMs中发现NR_109高表达，并且与胃癌和乳腺癌患者的不良临床分期呈正相关。
结论
我们的工作首次揭示NR_109通过NR_109/FUBP1/c-Myc正反馈环在调节M2样巨噬细胞的表型重塑和功能中发挥关键作用。因此，NR_109在癌症的诊断、预后和免疫治疗中具有巨大的转化潜力。
关键词：巨噬细胞，肿瘤微环境，免疫治疗
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- lncRNA NR_109在M2样巨噬细胞极化及肿瘤进展中的功能和机制是什么？
- 核心机制
- NR_109通过竞争性结合FUBP1的C端结构域，阻碍JTV-1介导的FUBP1泛素化降解，从而稳定FUBP1蛋白，激活c-Myc转录，促进M2样巨噬细胞极化；同时c-Myc结合NR_109启动子增强其转录，形成正反馈环路。
- 主要证据
- 体外实验显示NR_109敲低抑制IL-4诱导的M2极化，体内实验显示敲低NR_109的M2巨噬细胞减弱肿瘤生长和转移；机制实验（RNA pull-down、RIP、CHX追踪、MG132处理、ChIP、双荧光素酶报告）证实NR_109/FUBP1/c-Myc环路。
- 研究意义
- NR_109具有作为癌症诊断、预后标志物和免疫治疗靶点的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NR_109对M2样巨噬细胞极化的功能验证
验证NR_109是否影响M2样巨噬细胞极化。
在M2样巨噬细胞中敲低或过表达NR_109，检测M2标志物（CD206、Arg-1等）和细胞因子（IL-10、TGF-β等）的表达。
NR_109对肿瘤细胞增殖和迁移的体外影响
评估NR_109敲低的M2样巨噬细胞对肿瘤细胞增殖和迁移的影响。
用M2-NR_109low细胞的条件培养基培养肿瘤细胞（AGS、MDA-MB-231等），检测增殖（MTS、EdU）和迁移（Transwell）。
NR_109对肿瘤生长的体内影响
验证NR_109敲低的M2样巨噬细胞对肿瘤生长的影响。
将BGC-823细胞与M2sh-NR_109或M2sh-NC细胞混合皮下注射HSC-NPG小鼠，监测肿瘤生长。
NR_109对肿瘤转移的体内影响
验证NR_109敲低的M2样巨噬细胞对肿瘤转移的影响。
将BGC-823细胞与M2sh-NR_109或M2sh-NC细胞混合尾静脉注射裸鼠，观察肺转移。
NR_109与FUBP1相互作用的机制研究
鉴定NR_109相互作用的蛋白，并验证其结合位点。
通过RNA pull-down、质谱、RIP、截短探针实验确定NR_109与FUBP1相互作用，并定位结合区域。
NR_109调节FUBP1稳定性的机制研究
验证NR_109是否通过竞争JTV-1抑制FUBP1泛素化降解。
使用CHX追踪FUBP1降解，MG132抑制蛋白酶体，Co-IP检测FUBP1与JTV-1相互作用，以及泛素化水平。
FUBP1/c-Myc通路对M2极化的影响
验证FUBP1是否通过c-Myc促进M2极化。
在M2样巨噬细胞中敲低或过表达FUBP1或c-Myc，检测c-Myc表达和M2标志物。
c-Myc对NR_109转录的调控验证
验证c-Myc是否直接结合NR_109启动子并增强其转录。
ChIP和双荧光素酶报告实验检测c-Myc与NR_109启动子结合。
临床样本中NR_109/FUBP1/c-Myc表达相关性分析
评估NR_109与FUBP1、c-Myc在临床肿瘤样本中的表达相关性及其临床意义。
通过ISH和IHC检测GC、BC组织CD68+ TAMs中NR_109、FUBP1、c-Myc的表达，分析相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibico | -- |
| DMEM培养基 | Gibico | -- | |
| 胎牛血清 | BI | -- | |
| 巨噬细胞诱导 | 佛波醇酯 | Sigma | -- |
| 脂多糖 | Sigma | -- | |
| 干扰素-γ | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | -- | |
| 细胞分离 | 人CD14+磁珠 | Miltenyi Biotec | -- |
| 细胞培养 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 微阵列分析 | Agilent SBC人lncRNA微阵列V.6.0 | Agilent | -- |
| 组织消化 | 脱氧核糖核酸酶I | Takara | -- |
| 胶原酶IV | Sigma | -- | |
| RACE | 5'和3' cDNA末端快速扩增试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| NEOFECT DNA转染试剂 | NEOFECT | -- | |
| qRT-PCR | SYBR Green PCR试剂盒 | Promega | -- |
| 实时荧光定量PCR系统（ABI 7500） | ABI | -- | |
| ELISA | IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-β ELISA试剂盒 | eBioscience | -- |
| 细胞增殖 | MTS溶液 | Promega | -- |
| 酶标仪（Cytation5） | BioTek | -- | |
| EdU实验 | Cell-Light EdU Apollo488体外试剂盒 | Ribobio | C10310-3 |
| Transwell | Transwell小室（24孔，8 μm孔径） | Corning Costar | -- |
| 流式细胞术 | PE标记抗CD86抗体 | eBioscience | 12-0869-42 |
| FITC标记抗CD206抗体 | eBioscience | MA5-16870 | |
| PE标记抗CD163抗体 | eBioscience | 12-1639-42 | |
| 小鼠IgG2b κ同型对照PE | eBioscience | 12-4732-81 | |
| 小鼠IgG1 κ同型对照Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-4714 | |
| PE/cyanine 5标记抗CD11b抗体 | Elabscience | E-AB-F1081G | |
| PE/cyanine 5大鼠IgG2b κ同型对照 | Elabscience | E-AB-F09842G | |
| CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP抗体 | BD | 340298 | |
| CD3-FITC/CD16+56 PE抗体 | BD | 340042 | |
| 小鼠IgG1 PE | BD | 349043 | |
| 小鼠IgG1 FITC | BD | 349041 | |
| 小鼠IgG2a PerCP | BD | 349054 | |
| 流式细胞仪 | Navios流式细胞仪 | Beckman | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗c-Myc抗体 | Abcam | ab39688 | |
| 抗FUBP1抗体 | Proteintech | 24864-1-AP | |
| 抗JTV-1抗体 | Proteintech | 10424-1-AP | |
| 抗泛素抗体 | Abcam | ab134953 | |
| 抗CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 抗SCARB1抗体 | Proteintech | 21277-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗体稀释液 | Absin | abs954 | |
| IRDye 800CW山羊抗兔IgG二抗 | LI-COR | 926-32211 | |
| IRDye 680RD山羊抗小鼠IgG二抗 | LI-COR | 926-68070 | |
| Odyssey成像系统 | Millipore | -- | |
| 体内成像 | 活体成像系统（NightOWL II LB983） | Berthold | -- |
| RNA FISH | Ribo荧光原位杂交试剂盒 | Ribobio | -- |
| NR_109探针（Cy3标记） | Ribobio | -- | |
| 18S RNA探针（Cy3标记） | Ribobio | -- | |
| U6探针（Cy3标记） | Ribobio | -- | |
| 共聚焦激光扫描显微镜（A1RHD25） | Nikon | -- | |
| 免疫荧光 | 抗CD206抗体 | Abcam | ab64693 |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Proteintech | 27309-1-AP |
| 抗E-cadherin抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| 抗Vimentin抗体 | Proteintech | 10366-1-AP | |
| 抗N-cadherin抗体 | Proteintech | 22018-1-AP | |
| 抗CD4抗体 | MXB | RMA-0620 | |
| 抗CD8抗体 | MXB | RMA-0514 | |
| 抗CD163抗体 | Sigma-Aldrich | 163M-14-RUO | |
| 抗CD68抗体 | DAKO | M0876 | |
| 抗FUBP1抗体 | ZENBIO | R24365 | |
| 抗c-Myc抗体 | Abcam | ab39688 | |
| DAB底物液 | Agilent | -- | |
| RNA pull-down | 生物素RNA标记混合物 | Roche | -- |
| 链霉亲和素琼脂糖珠 | GE Healthcare | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| ChIP | Magana ChIP A/G试剂盒 | Merck | 17-10086 |
| 荧光素酶报告 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 动物实验 | HSC-NPG小鼠 | Vitalstar Biotechnology | -- |
| BALB/c裸鼠 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 巨噬细胞极化模型 | THP-1细胞用PMA（50 ng/mL）诱导48小时为M0；M1极化需LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL），M2极化需IL-4（20 ng/mL）；PBMC来源的单核细胞分化：GM-CSF（10 ng/mL）或M-CSF（25 ng/mL）处理6天，M1需LPS/IFN-γ，M2需IL-4（25 ng/mL）。 阅读提示：Methods: Preparation and simulation of macrophages |
| NR_109敲低/过表达 | siRNA序列见补充表3；转染试剂Lipofectamine 2000或NEOFECT；转染后24-72小时收获。 阅读提示：Methods: Transfection, 补充材料表3 |
| 体外功能实验 | 条件培养基使用30%浓度；MTS法肿瘤细胞5×10^3/孔，6个重复，检测0、24、48小时；Transwell中肿瘤细胞1×10^5/孔，巨噬细胞2×10^5/孔，迁移15-20小时。 阅读提示：Methods: Cell proliferation assay, EdU incorporation assay, Transwell assay |
| 体内肿瘤生长实验 | HSC-NPG小鼠（16周龄，hCD45+≥50%）；BGC-823细胞与巨噬细胞3:1混合皮下注射；每组6只；在21天和30天观察肿瘤生长。 阅读提示：Methods: Xenograft tumor formation and metastasis assay in mice model |
| 体内转移实验 | BALB/c裸鼠；BGC-823细胞与巨噬细胞3:1混合尾静脉注射；每组6只；60天后检测肺转移结节。 阅读提示：Methods: Xenograft tumor formation and metastasis assay in mice model |
| 机制研究 | RNA pull-down、RIP、ChIP、双荧光素酶报告等实验的具体条件，如抗体、引物序列等。 阅读提示：Methods: Biotin-RNA pulldown assay, RNA-immunoprecipitation assay, Chromatin immunoprecipitation assay, Luciferase reporter assay |
| 临床样本分析 | 患者样本来源、Ⅰ-Ⅳ期胃癌和乳腺癌；组织处理、ISH和IHC评分标准。 阅读提示：Methods: Patients and healthy donors, In situ hybridization, Immunofluorescence and IHC staining |