内部m7G修饰的鉴定与定量
确认mRNA内部存在m7G修饰，并评估其在不同RNA类型和亚细胞组分中的分布。
通过LC-MS/MS检测总RNA、小RNA、rRNA、去帽polyA+ mRNA及其核质组分中的m7G/G水平。
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QKI将内部m7G修饰的转录本转运至应激颗粒并调控mRNA代谢
QKI shuttles internal m7G-modified transcripts into stress granules and modulates mRNA metabolism.
实验完整度
高多细胞系体外模型、动物移植瘤模型及患者来源细胞系，包含功能验证（敲除/过表达）和机制验证（结合、转运、翻译调控）。
主要模型
HeLa细胞 HepG2细胞 U2OS细胞 NSG小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
QKI7与G3BP1在应激条件下的相互作用（Co-IP、PLA） 内部m7G修饰mRNA在应激颗粒中的富集（IF、LC-MS/MS） QKI7调控靶mRNA稳定性和翻译效率（RNA-seq、Ribo-seq、多聚核糖体分析） QKI7对化疗药物敏感性的影响（IC50、凋亡、克隆形成、体内移植瘤） METTL1介导的内部m7G修饰对QKI7结合的依赖性（METTL1敲除后RIP-seq）
摘要
N7-甲基鸟苷（m7G）修饰通常发生在mRNA的5'帽结构或tRNA/rRNA内部，但也存在于信使RNA（mRNA）的内部。虽然m7G帽结构对前体mRNA加工和蛋白质合成至关重要，但mRNA内部m7G修饰的确切作用仍不清楚。在此，我们报道mRNA内部m7G被Quaking蛋白（QKIs）选择性识别。通过对内部m7G甲基化组和QKI结合位点的全转录组分析/定位，我们鉴定出超过1,000个高置信度的m7G修饰且QKI结合的mRNA靶标，这些靶标具有保守的“GANGAN（N = A/C/U/G）”基序。引人注目的是，QKI7通过其C端与应激颗粒（SG）核心蛋白G3BP1相互作用，并将内部m7G修饰的转录本转运至应激颗粒中，以在应激条件下调控mRNA稳定性和翻译。具体而言，QKI7减弱Hippo信号通路中关键基因的翻译效率，从而使癌细胞对化疗敏感。总之，我们鉴定出QKIs是mRNA内部m7G结合蛋白，可调控靶mRNA代谢和细胞耐药性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mRNA内部m7G修饰的生物学功能及其被何种蛋白识别，以及该修饰在应激条件下如何调控mRNA代谢。
- 核心机制
- QKI7通过其C端与应激颗粒核心蛋白G3BP1相互作用，将内部m7G修饰的mRNA转运至应激颗粒中，从而调控这些mRNA的稳定性和翻译效率。
- 主要证据
- 通过全转录组m7G MeRIP-seq和QKI RIP-seq鉴定出大量m7G修饰且QKI结合的mRNA；Co-IP和PLA证实QKI7与G3BP1在应激下相互作用；IF和LC-MS/MS显示m7G修饰mRNA在应激颗粒中富集；RNA-seq和Ribo-seq表明QKI7抑制靶mRNA翻译；体内移植瘤实验证明QKI7增强化疗敏感性。
- 研究意义
- 揭示了QKIs作为mRNA内部m7G结合蛋白的新功能，阐明了内部m7G修饰在应激条件下重塑应激颗粒转录组的作用，并提示靶向QKI7可能增强化疗疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
METTL1-WDR4对内部m7G的调控
验证METTL1-WDR4复合物是否负责mRNA内部m7G沉积。
在HeLa和HepG2细胞中敲除或过表达METTL1/WDR4，通过LC-MS/MS检测小RNA和去帽polyA+ mRNA中m7G/G水平变化。
内部m7G结合蛋白的筛选与鉴定
鉴定特异性结合mRNA内部m7G修饰的蛋白质。
使用含m7G或G的60-mer RNA寡核苷酸进行RNA亲和层析结合质谱，并通过RNA pulldown、RIP和EMSA验证候选蛋白QKI的结合特异性。
全转录组m7G甲基化组和QKI结合位点图谱
在全转录组水平鉴定m7G修饰位点和QKI结合靶标，并分析其重叠和基序。
在HepG2和U2OS细胞中进行m7G MeRIP-seq和QKI RIP-seq，分析m7G峰分布、基序及与QKI结合峰的重叠。
QKI与G3BP1的相互作用及应激颗粒定位
验证QKI6/7在应激条件下与应激颗粒核心蛋白G3BP1的相互作用和共定位。
通过Co-IP、PLA和免疫荧光在正常和应激条件下检测QKI6/7与G3BP1的相互作用和共定位，并利用截短体定位相互作用结构域。
QKI7将内部m7G修饰mRNA转运至应激颗粒
验证QKI7是否依赖m7G修饰将mRNA转运至应激颗粒。
通过同时检测polyA和m7G信号的免疫荧光、应激颗粒分离结合LC-MS/MS，以及QKI敲除/过表达和METTL1敲除实验，评估m7G修饰mRNA在应激颗粒中的富集。
QKI7调控靶mRNA稳定性和翻译效率
评估QKI7对应激颗粒富集的m7G修饰mRNA稳定性和翻译的影响。
通过mRNA稳定性测序、多聚核糖体分析和Ribo-seq，检测QKI7过表达或敲除对靶mRNA半衰期和翻译效率的影响。
QKI7通过Hippo通路调控化疗敏感性
验证QKI7是否通过抑制Hippo通路关键基因翻译增强化疗敏感性。
通过IC50测定、凋亡分析、克隆形成实验和体内移植瘤模型，评估QKI7对多柔比星敏感性的影响，并验证GSK3B和TEAD1的回复作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Gemini Bio-Products | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | 多柔比星 | Sigma-Aldrich | 44583 |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr-1 |
| 质粒构建 | CloneAmp HiFi PCR预混液 | Takara | 639298 |
| In-Fusion克隆Plus CE试剂盒 | Takara | 638916 | |
| 质粒提取 | QIAprep离心柱质粒小提试剂盒 | Qiagen | 27104 |
| 慢病毒包装 | X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Sigma-Aldrich | 6366546001 |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 |
| 细胞筛选 | 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl-1 |
| 潮霉素 | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒8 | Dojindo | CK04 |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | Sigma-Aldrich | V5265 |
| 流式细胞术 | APC Annexin V凋亡检测试剂盒 | Biolegend | 640932 |
| 邻位连接实验 | Duolink原位PLA抗兔PLUS探针 | Sigma-Aldrich | DUO92002 |
| Duolink原位PLA抗小鼠MINUS探针 | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| Duolink原位检测试剂红色 | Sigma-Aldrich | DUO92008 | |
| 含DAPI的Duolink原位封片剂 | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| RNA FISH | Stellaris RNA FISH杂交缓冲液 | Biosearch Technologies | SMF-HB1-10 |
| Stellaris RNA FISH洗涤缓冲液A | Biosearch Technologies | SMF-WA1-60 | |
| 免疫荧光 | 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 |
| 抗G3BP1抗体 | Proteintech | 13057-2-AP | |
| 抗m7G抗体 | MBL International | RN017M | |
| Western blot | RIPA裂解提取缓冲液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78438 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78426 | |
| NE-PER核质分离试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| 线粒体分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89874 | |
| Pierce ECL蛋白质印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | PI32106 | |
| Amersham ECL Prime蛋白质印迹检测试剂 | Cytiva | RPN2232 | |
| 免疫共沉淀 | Pierce免疫沉淀裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 87787 |
| Protein A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88803 | |
| RNase A/T1混合物 | Thermo Scientific | EN0551 | |
| EMSA | 荧光素标记的G寡核苷酸和m7G寡核苷酸 | -- | -- |
| RT-qPCR | QuantiTect逆转录试剂盒 | Qiagen | 205314 |
| SYBR Green qPCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | FERK0253 | |
| LC-MS/MS | 烟草去帽酶Plus 2 | Enzymax | 94 |
| 核酸酶P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| FastAP碱性磷酸酶 | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | |
| m7G标准品 | Cayman Chemical Company | -- | |
| 斑点印迹 | 抗m6A抗体 | Synaptic Systems | 202003 |
| Amersham Hybond-N+膜 | Cytiva | RPN303B | |
| RNA pulldown | Pierce RNA 3'端生物素标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20160 |
| Pierce磁珠RNA蛋白下拉试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 20164 | |
| RIP-seq | M-PER缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 78501 |
| m7G MeRIP-seq | NEBNext镁离子RNA片段化模块 | New England Biolabs | E6150S |
| T4多核苷酸激酶 | Thermo Fisher Scientific | EK0032 | |
| RNA清洁浓缩试剂盒 | Zymo Research | R1015 | |
| Ribo-seq | 微球菌核酸酶 | New England Biolabs | M0247S |
| SUPERase-In RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | AM2696 | |
| 蛋白质纯化 | Pierce抗DYKDDDDK磁珠琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | A36797 |
| Pierce 3x DYKDDDDK肽 | Thermo Fisher Scientific | A36805 | |
| 体外转录 | MEGAshortscript T7转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1354 |
| m7GTP | Sigma-Aldrich | M6133 | |
| 化学裂解实验 | 苯胺 | Sigma-Aldrich | 242284 |
| Northern blot | NorthernMax试剂盒 | Invitrogen | AM1940 |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Abcam | ab7403 | |
| 细胞培养 | PCR支原体检测试剂盒 | Applied Biological Materials | G238 |
| Dynabeads Oligo(dT)25磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 61005 | |
| RNA纯化 | TURBO DNA酶 | Thermo Fisher Scientific | AM2239 |
| RNA清洁浓缩试剂盒 | Zymo Research | R1014 | |
| mirVana miRNA分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | AM1560 | |
| NEBNext rRNA去除试剂盒 | New England Biolabs | E6310S | |
| 应激颗粒分离 | Dounce匀浆器 | -- | -- |
| 蛋白质定量 | 蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | 500-0002EDU |
| SUnSET | 抗嘌呤霉素抗体 | EMD Millipore | MABE343 |
| 丽春红S | Sigma-Aldrich | P7170-1L | |
| 多聚核糖体分析 | 梯度制备仪 | BioComp Instruments | -- |
| Optima L-100 XP超速离心机 | -- | SW41i | |
| 活塞梯度分液器 | BioComp Instruments | -- | |
| ECONO紫外监测仪 | BioRad | -- | |
| Ribo-seq | Trizol LS试剂 | Thermo Fisher Scientific | 10-296-010 |
| Zymo小RNA PAGE凝胶回收试剂盒 | Zymo Research | R1070 | |
| T4多核苷酸激酶 | New England Biolabs | M0201S | |
| 寡核苷酸清洁浓缩试剂盒 | Zymo Research | D4060 | |
| NEBNext小RNA文库构建试剂盒 | New England BioLabs | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 应激处理 | 亚砷酸钠浓度（500 μM）、处理时间（0.5–2小时）及热休克条件（42°C 1小时） 阅读提示：STAR Methods中Cell Culture小节 |
| QKI7与G3BP1相互作用检测 | 细胞系（HEK293T、U2OS、HeLa）、应激诱导条件、抗体用量（anti-FLAG 1:500，anti-G3BP1 1:300）及PLA探针 阅读提示：STAR Methods中Co-Immunoprecipitation和Proximity Ligation Assay小节，Figure 3图注 |
| m7G MeRIP-seq | mRNA片段化大小（100 nt）、去帽酶用量、anti-m7G抗体用量（4 μg）、IP缓冲液及测序平台 阅读提示：STAR Methods中m7G-MeRIP-seq小节 |
| QKI RIP-seq | 细胞系（HepG2或U2OS）、Flag-QKI过表达、紫外交联能量（150 mJ/cm2）、anti-FLAG抗体用量（5 μg）及测序平台 阅读提示：STAR Methods中RNA Immunoprecipitation (RIP)-seq小节 |
| mRNA稳定性分析 | 放线菌素D浓度（5 μg/mL）、亚砷酸钠浓度（200 μM）、处理时间点（0、4、8小时）及ERCC spike-in 阅读提示：STAR Methods中mRNA Stability Profiling小节 |
| 体内移植瘤实验 | 小鼠品系（NSG）、细胞接种数量（1×10^7）、小鼠周龄（6周）、多柔比星剂量（1 mg/kg）及给药频率（每三天一次，共四次） 阅读提示：STAR Methods中Animal Studies小节 |