单细胞多组学鉴定前列腺CTC
确认候选CTC的身份并获取其DNA甲基化和转录组数据
从转移性前列腺癌患者血液中富集CTC，显微操作挑取单细胞，进行配对单细胞DNA甲基化测序（scBS-seq）和RNA-seq（SMART-seq2）
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DNA低甲基化在早期前列腺癌和循环肿瘤细胞中沉默抗肿瘤免疫基因
DNA hypomethylation silences anti-tumor immune genes in early prostate cancer and CTCs.
实验完整度
高包含患者CTC、组织单核、细胞系、小鼠模型等多层级证据，并有功能回补和机制验证。
主要模型
患者来源的前列腺CTC 前列腺癌及正常前列腺细胞系 局部前列腺癌组织切片单核 Myc-CaP小鼠前列腺癌模型
重点核对
CTC鉴定：38/44个候选CTC经转录组和DNA拷贝数确认 核心PMD定义：4例患者CTC和4个细胞系中平均分位数归一化甲基化<25% 5-氮杂胞苷处理BPH-1细胞：5 μM，处理0、1、4、5天 GSK126处理前列腺癌细胞系：0、5或10 μM，6天 Myc-CaP细胞接种量：前列腺内或皮下注射50,000个细胞，与Matrigel 1:1混合
摘要
癌症的特征是大型染色质结构域的低甲基化相关沉默，但其在肿瘤发生中的作用尚不确定。通过高分辨率全基因组单细胞DNA甲基化测序，我们从最早可检测的前列腺恶性肿瘤阶段到转移性循环肿瘤细胞（CTC）中，鉴定出40个一致低甲基化的核心结构域。这些抑制性结构域中嵌套着保留甲基化、逃逸沉默且富集细胞增殖基因的较小位点。核心低甲基化结构域内转录沉默的基因富集免疫相关基因；其中突出的是一个包含所有五个CD1基因（向NKT细胞呈递脂质抗原）和四个IFI16相关干扰素诱导基因（参与先天免疫）的单一基因簇。在免疫健全小鼠中重新表达CD1或IFI16的小鼠直系同源基因可消除肿瘤发生，并伴随抗肿瘤免疫的激活。因此，早期表观遗传改变可能通过靶向特定染色体位点内的共定位基因来塑造肿瘤发生。低甲基化结构域可在富集CTC的血液标本中检测到。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 早期前列腺癌发生过程中DNA低甲基化是否靶向特定基因并影响肿瘤发生？
- 核心机制
- 早期低甲基化核心结构域沉默免疫相关基因（如CD1A-IFI16基因簇），同时保留增殖相关基因；低甲基化伴随H3K27me3沉积导致基因沉默。
- 主要证据
- 单细胞DNA甲基化测序鉴定40个核心PMD；GSEA显示免疫通路富集；5-氮杂胞苷和GSK126处理改变CD1A-IFI16表达；小鼠中回补Cd1d1或Ifi204抑制肿瘤生长并激活抗肿瘤免疫。
- 研究意义
- 早期表观遗传改变可能塑造肿瘤发生，低甲基化结构域为血液中CTC检测提供潜在标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
定义PMD和PMI
鉴定肿瘤细胞中低甲基化结构域及其中保留甲基化的岛屿
将基因组划分为100 kb窗口，根据双峰分布设定阈值定义低甲基化窗口，合并为PMD；定义PMD间保留甲基化的小区域为PMI
鉴定核心PMD和核心PMI
找出跨多个独立样本一致存在的结构域
对4例患者CTC和4个细胞系的PMD取交集，计算分位数归一化甲基化水平，定义核心PMD和核心PMI
分析核心PMD在肿瘤发生中的时序
确定核心PMD低甲基化是否发生于早期前列腺癌
对Gleason 6、Gleason≥8肿瘤组织切片和正常前列腺组织进行单核DNA甲基化测序，并重分析TCGA甲基化数据
关联基因表达与功能通路
探究核心PMD和PMI内基因的表达变化及通路富集
利用TCGA前列腺癌数据比较正常与肿瘤组织的基因表达，进行GSEA分析
验证CD1A-IFI16位点的表观遗传调控
验证DNA低甲基化与抑制性染色质标记及基因沉默的因果关系
用5-氮杂胞苷处理BPH-1细胞诱导低甲基化，用GSK126抑制EZH2降低H3K27me3，检测CD1A-IFI16基因表达和染色质标记
小鼠体内回补CD1d1或Ifi204
验证重新表达CD1A-IFI16同源基因是否抑制肿瘤发生并激活抗肿瘤免疫
在Myc-CaP细胞中过表达Cd1d1或Ifi204，接种至免疫健全FVB小鼠或免疫缺陷NSG小鼠，监测肿瘤生长和免疫浸润
Nanopore测序检测血液低甲基化信号
评估低甲基化结构域作为血液CTC检测标志物的可行性
对白细胞去除后的血液样本进行Nanopore长读长测序，计算PMD低甲基化信号
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
检测血液低甲基化信号
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CTC分离 | 生物素化小鼠抗CD45抗体（克隆2D1） | R&D Systems | BAM1430 |
| 小鼠抗CD66b抗体（克隆80H3） | Bio-Rad | MCA216T | |
| 生物素化小鼠抗人CD16抗体（克隆3G8） | BD Biosciences | 555405 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1磁珠 | Invitrogen | 65-601 | |
| CTC鉴定 | AF488标记的小鼠抗人EpCAM抗体（克隆VU1D9） | Cell Signaling Technology | 5198 |
| PE标记的小鼠抗CD45抗体（克隆HI30） | BD Biosciences | 560975 | |
| Western blot | 兔抗组蛋白H3K27me3抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-11198 |
| 兔抗总组蛋白H3抗体 | Abcam | 1791 | |
| ChIP和CUT&RUN | 兔抗组蛋白H3K27me3抗体 | Active motif | 39155 |
| ChIP | 兔抗组蛋白H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 |
| CUT&RUN | 兔IgG对照抗体（克隆DA1E） | Cell Signaling Technology | 66362 |
| 免疫荧光 | 兔抗H3K27me3抗体（克隆C36B11） | Cell Signaling Technology | CST#9733 |
| 流式细胞术 | APC标记的小鼠抗人CD1d抗体 | BioLegend | 350308 |
| APC标记的小鼠抗人CD1d抗体（克隆CD1d42） | BD Biosciences | 563505 | |
| APC标记的同型对照抗体 | BD Biosciences | 555751 | |
| 大鼠抗小鼠CD1d抗体（克隆20H2） | Bio X Cell | BE0179 | |
| 大鼠抗小鼠同型对照抗体（克隆HRPN） | Bio X Cell | BE0088 | |
| APC标记的山羊抗大鼠IgG抗体 | Thermo Fisher Scientific | A10540 | |
| 大鼠抗小鼠CD16/CD32封闭试剂（克隆2.4G2） | BD Biosciences | 553142 | |
| BV510活性染料 | BD Biosciences | 564406 | |
| APC标记的α-GalCer-mCD1d四聚体 | TetramerShop | MCD1d-001 | |
| BV711标记的抗小鼠CD69抗体（克隆H1.2F3） | BioLegend | 104537 | |
| PerCP-Cy5.5标记的抗小鼠TCRβ抗体（克隆H57-597） | Biolegend | 109228 | |
| BV605标记的抗小鼠CD3e抗体（克隆145-2C11） | BioLegend | 100351 | |
| BUV395标记的抗小鼠NK1.1抗体（克隆PK136） | BioLegend | 564144 | |
| BV711标记的抗小鼠CD8a抗体（克隆53-6.7） | BioLegend | 100759 | |
| BV650标记的抗小鼠CD4抗体（克隆RM4-5） | BioLegend | 100546 | |
| FITC标记的抗小鼠CD44抗体（克隆IM7） | BioLegend | 103006 | |
| PE-Cy7标记的抗小鼠PD-1抗体（克隆RMP1-30） | BioLegend | 109110 | |
| BV421标记的抗小鼠TIM3抗体（克隆5D12） | BioLegend | 747626 | |
| APC标记的抗小鼠TIGIT抗体（克隆4D4/mTIGIT） | BioLegend | 156106 | |
| BV785标记的抗小鼠LAG3抗体（克隆C9B7W） | BioLegend | 125219 | |
| PE标记的抗小鼠TNFα抗体（克隆MP6-XT22） | BioLegend | 506306 | |
| BV605标记的抗小鼠IFNγ抗体（克隆XMG1.2） | BioLegend | 505840 | |
| 药物处理 | 5-氮杂胞苷 | Selleck | S1782 |
| GSK126 | Selleckchem | S7061 | |
| MNase native ChIP-seq | 微球菌核酸酶 | NEB | M0247S |
| 细胞培养 | G418 | Sigma Aldrich | G8168 |
| 杀稻瘟菌素 | InvivoGen | ant-bl-05 | |
| 流式细胞术 | 细胞刺激混合物 | eBioscience | 00-4970-93 |
| 蛋白转运抑制剂混合物 | eBioscience | 00-4980 | |
| DNA甲基化测序 | EZ DNA甲基化试剂盒 | Zymo | D5001 |
| 亚硫酸氢盐PCR克隆 | Zero blunt PCR克隆试剂盒 | ThermoFisher | K270020 |
| 单细胞分离 | MyOne羧酸磁珠 | Invitrogen | 65011 |
| ChIP-seq和Cut and Run文库构建 | NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7645L |
| Cut and Run | CUT&RUN实验试剂盒 | Cell Signaling Technology | 86652S |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| qRT-PCR | SuperScript III一步法qRT-PCR试剂盒 | Invitrogen | 11732020 |
| 质粒构建 | NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒 | NEB | E5520S |
| 流式细胞术 | BD固定/透化溶液试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| Nanopore测序 | 高分子量DNA提取试剂盒 | QIAGEN | 67563 |
| 快速条形码试剂盒 | Nanopore | SQK-RBK004 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 2000试剂 | Invitrogen | 1668019 |
| 病毒浓缩 | LentiX浓缩器 | Clontech Labs | NC0448638 |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | Santa Cruz | sc-134220 |
| Nanopore测序 | Nanopore MinION设备及R9.4流动池 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106D |
| Western blot | HRP标记的二抗 | Bio-rad | 5196-2504 |
| 细胞裂解 | Laemmli缓冲液 | Sigma | S3401-10VL |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞DNA甲基化测序 | 测序深度：每个样本检测约900万个CpG位点；亚硫酸氢盐转化率>98%；覆盖至少一次的独特CpG位点>400万 阅读提示：Methods：Paired single-cell DNA methylation and RNA-seq；Single-cell and bulk DNA methylation sequencing data analysis |
| PMD和PMI定义 | 窗口大小100 kb，偏移200 bp；排除CGI和gap区域；阈值设定；PMD最小长度250 kb；PMI长度30 kb-3 Mb 阅读提示：Methods：Determination of Partially Methylated Domains (PMDs)；Determination of Preserved Methylation Islands (PMIs) |
| 5-氮杂胞苷处理 | 药物浓度5 μM；处理时间0、1、4、5天；DMSO对照 阅读提示：Methods：5-Azacytidine treatment, bisulfite sequencing and staining of chromatin marks |
| GSK126处理 | 药物浓度0、5、10 μM；处理6天；细胞系22Rv1、LNCaP、VCaP 阅读提示：Methods：EZH2 inhibitor treatment |
| 小鼠肿瘤模型 | 细胞接种量：Myc-CaP 50,000个细胞，LLC-1 1,000,000个细胞；与Matrigel 1:1混合；注射体积30 μl（前列腺内）或100 μl（皮下）；小鼠品系FVB、NSG、C57BL/6；周龄6-8周 阅读提示：Methods：Mouse xenograft assays；Figure 5 legend |
| Nanopore测序分析 | 每个read至少30个CpG位点；比对到PMD的reads数≥300（转移）或≥400（局部）；lambda DNA甲基化<1% 阅读提示：Methods：Nanopore data analysis；Figure 6 legend |