人胶质瘤GAM的单细胞转录与染色质图谱建立
解析mIDH、wtIDH胶质瘤及正常脑组织中GAM的转录和染色质可及性特征。
对手术样本解离后CD45+磁珠分选，进行平行scRNA-seq和scATAC-seq，基于标志基因注释GAM并比较不同IDH状态和正常脑样本。
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与胶质瘤进展相关的致病性人胶质瘤相关巨噬细胞亚群的鉴定
Characterization of a pathogenic subpopulation of human glioma associated macrophages linked to glioma progression.
实验完整度
高整合人手术样本scRNA-seq/scATAC-seq、流式分选、ChIP-seq、功能实验、mtscATAC-seq、CyCIF/MALDI-MSI及原位异种移植
主要模型
人胶质瘤手术样本及正常脑组织 mGAM与非mGAM分选细胞 BT142 IDH1突变低级别胶质瘤细胞系 NOD/SCID小鼠原位移植模型
重点核对
mGAM定义为ANXA1+HMOX1+IBA1+细胞，并用流式分选验证 低输入ChIP-seq验证FOSL2在mGAM预测位点的结合增强 TCGA GBM和LGG数据中FOSL2 regulon表达与总生存的关联 BT142与mGAM共培养后CD44+KI67+细胞及MES-like转录谱变化 BT142:mGAM共培养细胞原位植入NOD/SCID小鼠后的生存分析
摘要
原发性新发高级别胶质瘤（如胶质母细胞瘤）与低级别胶质瘤最终都会汇聚到一种常见的侵袭性表型，而这种进展的基础尚不明确。胶质瘤相关巨噬细胞（GAM）被认为强烈支持肿瘤生长，然而功能性亚群的稳健分离一直难以实现。我们假设可以通过基因调控网络（GRN）推断来解析GAM的功能性亚群，并证明一个由围绕激活蛋白-1转录因子FOSL2的GRN所定义的人GAM亚群在高级别胶质瘤中优先富集。我们提名ANXA1和HMOX1作为我们称为恶性相关GAM（mGAM）这一亚群的替代性细胞表面标志物，该亚群具有独特的促肿瘤特性，与外周血单核细胞共享部分个体发生，并在胶质瘤新转化区域中富集。mGAM可能在胶质瘤进展中发挥关键作用，并代表一个可能的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过基因调控网络推断解析人GAM中功能相关的致病性亚群，并明确其与胶质瘤进展的关系。
- 核心机制
- 以FOSL2为中心的AP-1转录因子调控网络定义mGAM亚群，该网络调控缺氧反应、ECM重塑和血管生成相关基因，并与单核细胞共享个体发生。
- 主要证据
- 人胶质瘤scRNA-seq/scATAC-seq整合与FigR推断出FOSL2 regulon；ANXA1/HMOX1流式分选及ChIP-seq验证FOSL2结合；mGAM在高级别肿瘤富集，体外促进ECM分泌、血管生成、侵袭并诱导CD4+FOXP3+ T细胞及BT142间质转化，体内加速肿瘤生长。
- 研究意义
- mGAM为GAM的多种表型及其促肿瘤功能提供统一解释，并将该表型与疾病进展相联系，提示其可作为预后生物标志物及更广泛GAM群体中的可靶向亚群。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GAM亚群GRN推断与FOSL2调控网络识别
通过GRN推断识别与高级别胶质瘤相关的GAM调控网络。
整合自有和公共scRNA-seq数据，MiloR鉴定archetypal cells，Optmatch配对scRNA-seq与scATAC-seq，FigR推断GRN和DORC。
ANXA1和HMOX1作为mGAM表面标志物的提名与验证
寻找可前瞻性分离mGAM的细胞表面标志物并验证其与FOSL2网络的对应关系。
基于FOSL2 regulon表面基因组合分类算法筛选标志物对，选择ANXA1/HMOX1，流式分选mGAM与非mGAM后进行低输入ChIP-seq检测FOSL2结合。
mGAM比例与肿瘤级别及IDH状态的关系验证
验证mGAM在患者样本中的分布及其与临床级别的关系。
对mIDH和wtIDH手术样本及非胶质瘤患者外周血CD45+细胞进行流式分析，计算mGAM比例并与级别和IDH状态比较。
mGAM促肿瘤功能评估
验证mGAM是否具有ECM分泌、血管生成、吞噬和抗原提呈等促肿瘤功能。
分选mGAM与非mGAM短期培养，检测上清vimentin和versican，HUVEC成管实验，pHrodo吞噬实验，以及抗原回忆实验和T细胞表型分析。
mGAM与单核细胞个体发生关系追踪
检验mGAM是否与外周血单核细胞共享骨髓来源。
对mGAM、非mGAM及匹配PBMC进行mtscATAC-seq，分析线粒体异质性并比较单核细胞来源变异比例。
mGAM空间分布与代谢特征分析
确定mGAM在胶质瘤组织中的空间定位及代谢特征。
对冷冻组织进行t-CyCIF和MALDI-MSI，共注册后比较mGAM富集区与非富集区代谢差异。
mGAM对低级别胶质瘤细胞的转化与体内促生长作用验证
验证mGAM是否能诱导体外间质转化并加速体内肿瘤进展。
将mGAM注入LGG来源OTC观察侵袭，与BT142共培养检测球体形成、CD44/KI67、MES-like转录谱和CHI3L1分泌，并将共培养后的BT142原位植入NOD/SCID小鼠。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | 木瓜蛋白酶 | Worthington | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | GIBCO/ThermoFisher | 11330032 |
| B-27添加剂（50×，无血清） | GIBCO/ThermoFisher | 17504044 | |
| N2添加剂 | GIBCO/ThermoFisher | 17502048 | |
| 重组人表皮生长因子 | R&D Systems | 236-EG-200 | |
| 重组人碱性FGF/FGF2/bFGF | R&D Systems | 233-FB-500 | |
| 重组人PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | |
| 重组人硫酸肝素 | R&D Systems | 5057-ST | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | GIBCO/ThermoFisher | 15140122 | |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque PLUS密度梯度介质 | Cytiva | 17144003 |
| Leucosept管 | Greiner | -- | |
| 细胞冻存 | BAMBANKER冻存液 | GC LYMPHOTEC | CS-02-001 |
| CD45+细胞富集 | 人CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 |
| 单核细胞分选 | 人CD14磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 |
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞3'文库与凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | 1000075 |
| 单细胞ATAC测序 | Chromium Chip E单细胞ATAC试剂盒 | 10x Genomics | 10000082 |
| Chromium i7多重试剂盒N，Set A | 10x Genomics | 1000084 | |
| 线粒体单细胞ATAC测序 | Chromium Next GEM单细胞ATAC试剂盒v2.0 | 10x Genomics | 1000406 |
| 低输入ChIP-seq | 低细胞ChIP-seq试剂盒 | Active Motif | 53086 |
| ChIP DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo Research | D5205 | |
| ThruPLEX DNA测序试剂盒 | Takara Bio Inc. | R400674 | |
| ELISA | FastScan总波形蛋白ELISA试剂盒 | Cell Signaling Technology | 87105 |
| 人Versican ELISA试剂盒（比色法） | Novus Biologicals | NBP2-75354 | |
| 人几丁质酶3样1/YKL-40 Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DC3L10 | |
| 吞噬实验 | pHrodo Red大肠杆菌生物颗粒 | ThermoFisher Scientific | P35361 |
| 血管生成成管实验 | Calcein AM细胞通透性染料 | ThermoFisher | C1430 |
| Geltrex无LDEV减生长因子基底膜基质 | GIBCO/ThermoFisher | A1413201 | |
| OTC侵袭实验 | 减生长因子Matrigel基质 | Corning | 354230 |
| T细胞刺激 | CEF肽池 | JPT Peptide Technologies | PM-CEF-S-4 |
| PepTivator SARS-CoV-2刺突蛋白S | Miltenyi Biotec | 130-126-701 | |
| T细胞分离 | EasySep人T细胞分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 17951 |
| 流式分析 | 抗人Annexin A1 XP（克隆D5V2T）（PE） | Cell Signaling Technology | 80994 |
| 抗人血红素加氧酶1（克隆EPR18161-128）（Alexa Fluor 647） | Abcam | ab189491 | |
| 抗人CD45（克隆2D1）（Brilliant Violet 750） | Biolegend | 368542 | |
| 抗人CD44（克隆G44-26）（BD OptiBuild BUV395） | BD Biosciences | 740297 | |
| CyCIF | 抗人IBA1（克隆EPR6136(2)）（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab195031 |
| 抗人FOSL2（克隆D2F1E）（未偶联） | Cell Signaling Technology | 19967 | |
| 抗人HIF1α（克隆EPR16897）（Alexa Fluor 647） | Abcam | ab208420 | |
| 抗人SOX2（克隆D6D9）（Alexa Fluor 555） | Cell Signaling Technology | 5179 | |
| 细胞消化 | Accutase细胞消化液 | Innovative Cell Technologies | NC9464543 |
| 细胞活力检测 | AO/PI活力染色 | Nexcelom Bioscience | NC0285242 |
| 流式固定破膜 | BD Cytofix/Cytoperm固定/破膜试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| GAM单细胞图谱 | wtIDH胶质瘤n=7、mIDH胶质瘤n=8、正常脑n=2；CD45+ MACS富集；scRNA-seq与scATAC-seq平行建库 阅读提示：Results第一部分及Methods“Parallel single-cell RNA and ATAC sequencing” |
| GRN推断与FOSL2 regulon定义 | 公共数据集来源；archetypal cells筛选阈值logFC>2、Spatial FDR<0.001；FOSL2 regulon为54个基因、large regulon为248个基因 阅读提示：Methods“Filtering for canonical wildtype, mutant and control cell populations”及“Defining the FOSL2 regulon signature”，Table S2 |
| mGAM标志物验证与流式分选 | mGAM定义为ANXA1+HMOX1+；CD45+细胞门控；分选后用于ChIP-seq和功能实验 阅读提示：Figure 3E–H及Methods“Flow Cytometry and Fluorescence Activated Cell Sorting” |
| 抗原回忆实验 | GAM与自体T细胞1:1共培养；CEF和SARS-CoV-2肽浓度1 μg/mL；常氧20%与缺氧3%；MHC阻断抗体10 μg/mL；hIL-2 10 IU/mL、hIL-15 10 ng/mL 阅读提示：Methods“Peptide stimulation of T cells”及“Intracellular cytokine staining and T cell phenotyping”，Figure 4F–J |
| OTC侵袭实验 | OTC为4 mm3；Matrigel包埋；mGAM注射50,000 cells/OTC；培养7天观察侵袭 阅读提示：Methods“Organotypic 3D culture Invasion Assay”，Figure 7A |
| BT142共培养与体内原位移植 | BT142与mGAM按1:1共培养；共培养至第11天；NOD/SCID小鼠12–16周龄；右侧纹状体注射2 μL、100,000 cells/μL 阅读提示：Methods“Low-grade glioma spheroid co-culture assay”及“In vivo Experiments”，Figure 7B–K |
| mtscATAC-seq线粒体溯源 | 匹配患者样本n=2；mGAM、非mGAM及CD14+单核细胞；650个高置信度线粒体突变；异质性阈值10% 阅读提示：Methods“Mitochondrial lineage tracing sample preparation”及“Mitochondrial lineage tracing analyses”，Figure 5 |