表观基因组引导的RNAi筛选鉴定RUNX1/ETO关键靶点
筛选维持t(8;21) AML所需的RUNX1/ETO转录靶点。
使用靶向RUNX1/ETO结合且响应敲低的基因的定制shRNA文库，在Kasumi-1和SKNO-1细胞中进行体外（连续传代和长期培养）和体内（NSG小鼠股骨内移植）筛选，通过doxycycline诱导shRNA表达，测序分析shRNA丰度变化。
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致癌转录因子RUNX1/ETO破坏细胞周期调控以驱动白血病转化
The Oncogenic Transcription Factor RUNX1/ETO Corrupts Cell Cycle Regulation to Drive Leukemic Transformation.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代患者样本、多种小鼠移植模型及表观基因组、转录组和功能验证。
主要模型
t(8;21) AML细胞系Kasumi-1和SKNO-1 患者来源原代AML细胞（含t(8;21)阳性与阴性） 免疫缺陷小鼠移植模型（NSG、RG、C57BL/6）
重点核对
RNAi筛选使用374个shRNA构建体靶向133个基因，在Kasumi-1和SKNO-1中进行，包括体外和体内臂，doxycycline诱导与非诱导组比较。 CCND2敲低使用两种验证的shRNA（shCCND2-1和-3）及siRNA（siCCND2-2和-4），进行竞争性增殖和移植实验。 Palbociclib体外使用浓度梯度处理72小时（细胞系）或96小时（原代AML），GI50测定；体内RG小鼠口服100 mg/kg每日一次，C57BL/6小鼠150 mg/kg/day或100 mg/kg/day。 ChIP-seq和DHS-seq分析CCND2位点−30 kb元件，使用siRE敲低RUNX1/ETO并与siMM对照比较。 患者来源AML细胞在MSC或MS-5饲养层上培养，palbociclib 300 nM处理72小时或96小时。
摘要
致癌转录因子如白血病融合蛋白RUNX1/ETO（驱动t(8;21)急性髓系白血病(AML)）构成癌症特异性但极具挑战性的治疗靶点。我们利用表观基因组分析数据指导RNAi筛选，以探究维持t(8;21) AML的转录网络。该策略将细胞周期蛋白D2(CCND2)鉴定为RUNX1/ETO驱动白血病增殖的关键传递因子。RUNX1/ETO与AP-1协同驱动CCND2表达。通过已批准药物敲低或药理学抑制CCND2，可显著损害患者来源AML细胞的白血病扩增及在免疫缺陷小鼠宿主中的植入。我们的数据表明，RUNX1/ETO通过促进细胞周期进程维持白血病，并确定G1期CCND-CDK复合物作为治疗RUNX1/ETO驱动AML的有前景的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RUNX1/ETO驱动的转录网络中，哪些关键靶点对t(8;21) AML的维持和自我更新至关重要，且可供药理学干预？
- 核心机制
- RUNX1/ETO通过直接结合CCND2上游−30 kb元件并间接支持AP-1家族成员表达和启动子结合，维持CCND2表达，从而促进G1期细胞周期进程和白血病增殖。
- 主要证据
- RNAi筛选在体外和体内鉴定CCND2为关键靶点；CCND2敲低抑制增殖、克隆形成和植入，诱导G1期阻滞和衰老；palbociclib抑制CDK4/6-CCND复合物，在细胞系、原代AML和小鼠模型中显示抗白血病活性。
- 研究意义
- 研究证明RUNX1/ETO通过促进细胞周期进程维持白血病，并确定G1期CCND-CDK复合物（尤其是CDK4/6）作为治疗RUNX1/ETO驱动AML的有前景靶点，palbociclib等药物可能用于治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CCND2为RUNX1/ETO转录靶点
探究RUNX1/ETO是否直接调控CCND2转录。
整合ChIP-seq和DHS-seq数据定位RUNX1/ETO在CCND2位点的结合，通过siRNA敲低RUNX1/ETO检测CCND2 RNA和蛋白水平变化，并在原代AML细胞中验证。
阐明RUNX1/ETO通过−30 kb元件和AP-1调控CCND2的机制
确定RUNX1/ETO调控CCND2的分子机制。
通过ChIP、DHS-seq、CHiC和HDAC抑制剂处理，分析RUNX1/ETO结合、染色质可及性、组蛋白乙酰化、RNA Pol II占据和三维启动子互动；通过dnFOS抑制AP-1功能，检测CCND2表达。
验证CCND2在白血病增殖和植入中的功能
确定CCND2对t(8;21) AML细胞增殖、克隆形成和体内植入的必需性。
使用shRNA和siRNA敲低CCND2，进行竞争性增殖和移植实验，检测细胞周期、凋亡、衰老和RB1磷酸化。
评估CDK4/6抑制剂palbociclib的体外和体内抗白血病效果
测试palbociclib对RUNX1/ETO驱动AML的疗效。
用palbociclib处理t(8;21)细胞系、原代AML细胞和预白血病细胞，检测增殖、克隆形成、细胞周期和衰老；在RG和C57BL/6小鼠模型中评估生存和白血病负荷。
探索palbociclib与KIT抑制剂的联合效应
测试G1期CDK抑制是否使AML细胞对KIT抑制敏感。
在Kasumi-1和SKNO-1细胞中联合使用palbociclib和imatinib，计算协同指数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 兔抗磷酸化Rb (Ser780)抗体 | Cell Signaling Technology | 9307 |
| 兔抗磷酸化Rb (Thr 826)抗体 | Abcam | ab133446 | |
| 兔抗磷酸化Rb (Thr821)抗体 | Abcam | ab4787 | |
| 鼠抗CCND2抗体 | Proteintech | 10934-1-AP | |
| 鼠抗Rb抗体 | BD Pharmingen | 554136 | |
| 兔抗AML1/RHD结构域(50-177)抗体 | Millipore | PC285 | |
| 兔抗AML1抗体 | Cell Signaling Technology | 4334 | |
| 鼠抗网格蛋白重链抗体 | BD Biosciences | 610500 | |
| 鼠抗β-肌动蛋白(HRP偶联)抗体 | Abcam | ab49900 | |
| 兔抗CDK6抗体 | Cell Signaling Technology | 13331 | |
| 鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(克隆6C5)抗体 | Hytest | 5G4-6C5 | |
| 山羊抗兔免疫球蛋白抗体 | Dako | P0448 | |
| 山羊抗鼠免疫球蛋白抗体 | Dako | P0447 | |
| 药物处理 | 帕博西尼异乙磺酸盐(体内用) | DC Chemicals | DC8470 |
| 帕博西尼(体外用) | DC Chemcials | DC5067 | |
| 伏立诺他(辛二酰苯胺异羟肟酸) | Sigma | SML0061 | |
| 伊马替尼 | Selleckchem | S2475 | |
| 质粒制备 | 无内毒素小量质粒制备试剂盒 | Mo Bio Laboratories | 12311-100 |
| Qiaprep离心小量制备试剂盒 | Qiagen | 27106 | |
| Qiaquick凝胶提取试剂盒 | Qiagen | 28706 | |
| 无内毒素质粒大量制备试剂盒 | Qiagen | 12362 | |
| PCR纯化 | UltraClean 96 PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 12596-4 |
| RNA提取 | RNAeasy小量试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| Qiashredder匀浆器 | Qiagen | 79656 | |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermoscientific | K1622 |
| DNA提取 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | 69506 |
| 蛋白定量 | Bio-Rad蛋白测定染料试剂浓缩液 | BioRad | 500-0006 |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | ThermoScientific | 23227 | |
| shRNA克隆 | One Shot STBL3化学感受态大肠杆菌 | Invitrogen | C7373-03 |
| siRNA敲低 | CCND2 siRNA | Qiagen | Hs_CCND2_2 FlexiTube SI00027839 and Hs_CCND2_4 FlexiTube SI00027853 |
| CCND1 siRNA | Qiagen | Hs_CCND1_3 FlexiTube SI00147826 | |
| 慢病毒包装 | pCMVΔ8.91包装载体 | Life Science Market | PVT2323 |
| pMD2.G包膜载体 | Addgene | 12259 | |
| shRNA表达 | pTRIPZ慢病毒载体 | Dharmacon (ThermoScientific) | RHS4750 |
| pLKO5d.SFFV.miRNA30n载体 | Addgene | 90333 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNAi筛选 | 细胞系（Kasumi-1和SKNO-1）、shRNA文库覆盖度（4×10^6细胞，10,000倍覆盖）、doxycycline诱导方案（移植时或移植后28天）、体内移植细胞数（SKNO-1 5×10^5，Kasumi-1 1×10^5） 阅读提示：Methods 'RNAI Screen Library'和'Mouse Transplantations'小节；Figure 1A |
| RUNX1/ETO敲低 | siRNA浓度（100-500 nM）、电转条件（330 V或350 V，10 ms）、检测时间点 阅读提示：Methods 'Knockdown Using siRNA Electroporation'小节 |
| CCND2敲低功能实验 | shRNA序列和混合比例（50:50）、siRNA序贯电转间隔（每2天）、竞争实验检测时间点（15天）、克隆形成检测时间（12天） 阅读提示：Methods 'shRNA Competition Assay'和'Colony Formation Assays'小节；Figure 4 |
| Palbociclib体外处理 | 药物浓度范围、处理时间（细胞系72小时，原代96小时）、GI50测定方法 阅读提示：Methods 'Drug Treatments'小节；Figure 6和Figure 7 |
| Palbociclib体内实验 | RG小鼠给药剂量（100 mg/kg每日一次）、给药方案（3个7天治疗块间隔7天）、C57BL/6小鼠给药剂量（150 mg/kg/day或100 mg/kg/day）和治疗块安排 阅读提示：Methods 'In Vivo Palbociclib Treatment'小节；Figure 7G-7K |
| 原代AML细胞培养与药物处理 | 饲养层细胞（MSC或MS-5）、palbociclib浓度（300 nM）、处理时间（72-96小时）、患者样本信息 阅读提示：Methods 'Primary Cultures'和'Drug Treatments'小节；Table S4 |